復方克霉唑乳膏中尿素及其縮二脲的質量控制*

賈微微，程 杰，吳小英，衛星紅，謝子立

（安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽合肥 230051）

復方克霉唑乳膏是由尿素、克霉唑與基質組成的消炎抗菌的外用復合制劑。尿素具有抗菌、增加皮膚角質層蛋白質的水合作用，可促進其他藥物的經皮吸收［1-2］。國外藥典均未收載該品種，其現行標準收載于2020 年版《中國藥典（二部）》［3］966，尿素含量測定方法與其收載的尿素乳膏及尿素軟膏相同，均采用顯色后紫外- 可見分光光度法。尿素分子中伯氨基在酸性條件下與對二甲氨基苯甲醛發生縮合反應，生成黃色的對二甲氨基苯縮脲衍生物。根據埃利希（Ehrlich）反應，對二甲氨基苯甲醛與各種含氮有機化合物作用均會發生顯色反應［4-5］，但方法專屬性差。2020 年版《中國藥典（二部）》［3］652、《歐洲藥典》［6］中尿素原料藥含量測定均采用凱氏定氮法，《美國藥典》中采用液相色譜法［7］，其他檢測方法還有比色法、折光率法、分光光度法、色譜法［8-11］等。復方克霉唑乳膏基質多、輔料多、尿素極性強，導致色譜法分離難度加大，目前未見采用色譜方法測定復方克霉唑乳膏中尿素含量的相關報道。為此，本研究中采用親水相互作用色譜（HILIC）Amide 色譜柱，結合紫外檢測器，建立測定復方克霉唑乳膏中的尿素及其縮二脲含量的高效液相色譜（HPLC）法，同時采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）法指認尿素的有關物質縮二脲。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Q Exactive Focus型四極桿- 高分辨軌道阱液質聯用儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；UV - 2700 型紫外- 可見分光光度計，LC - 40 AT 型高效液相色譜儀，均購自日本Shimadzu 公司；XS 105DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；PURA 22 型水浴鍋（德國Julabo 公司）；FD 240-UL 型電熱干燥箱（德國Binder公司）。

1.2 試藥

乙腈（色譜級/質譜級，美國Thermo Fisher Scientific公司）；甲酸（色譜純，天津光復精細化工研究所）；水為超純水；尿素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100288-201903，含量為99.8%）；縮二脲對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為C2011021，含量為99%）；復方克霉唑乳膏（A 廠家，共27 批次，其中批號為201003 用于方法學；B 廠家，共27 批次；C 廠家，共3 批次；D 廠家，共2 批次）；尿素原料藥（A 廠家，批號為 200806；B 廠家，批號為C01120 201007；C 廠家，批號為004120200902）；空白輔料由各廠家提供。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate HILIC Amide 柱（250 mm ×4.6 mm，5.0μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸溶液（95∶5，V/V）；流速：0.8 mL/ min；檢測波長：195 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10μL。

2.1.2 質譜條件

離子源：高頻火花誘導斷裂電離（HESI）源；檢測模式：正離子；鞘氣壓力：206.8 kPa；輔助氣體流量：10 mL/ min；噴霧電壓：3.80 kV；離子傳輸管溫度：300 ℃；輔助氣溫度：320 ℃；掃描模式：一級全掃描/數據依賴二級掃描（Full MS/dd-MS2）模式；分辨率：Full MS為70 000，dd - MS2為17 500；掃描范圍：55.000 00～825.000 00 質荷比（m/z）；隔離窗口：3.0m/z；二級質譜（MS/MS）模式碰撞能量：30/40/50 eV。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取尿素對照品與縮二脲對照品各適量，精密稱定，加乙醇溶解并稀釋成每1 mL含尿素0.5 mg、縮二脲2.5μg的溶液，即得。

供試品溶液：取樣品適量，精密稱定（約相當于尿素50 mg），置100 mL容量瓶中，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，用乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過，取續濾液，放至室溫，即得。

陰性對照品溶液：取A 廠家的空白輔料0.33 g，精密稱定，置100 mL 容量瓶中，精密加入克霉唑原料5 mg，加乙醇50 mL，熱浴加熱15 min，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過，取續濾液，放至室溫，即得。

2.3 縮二脲的質譜確認

取2.2 項下供試品溶液適量，按2.1 項下質譜條件測定，確認縮二脲的結構。縮二脲的準分子離子峰為m/z104.045 97［M + H］+，該加氫的準分子離子信號與縮二脲（精確分子量103.038 18）的分子式C2H5N3O2相匹配（質量偏差為0.6×10-6）。由圖1可知，二級質譜圖中m/z87.019 94 為母離子氨基加氫合物經脫氨氣（NH3）后得到，母離子羰基加氫合物經斷裂酰胺鍵后得到m/z61.040 50碎片。

圖1 縮二脲的二級質譜分析圖Fig.1 Secondary mass spectrometry of biuret

2.4 方法學考察

專屬性試驗：取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果顯示，溶劑無響應，陰性對照品溶液不干擾尿素及縮二脲的測定；尿素與縮二脲的色譜峰能實現完全分離，兩者間的分離度大于8。色譜圖見圖2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖1.Biuret 2.UreaA.Negative reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.2 HPLC chromatogram of the specificity test

破壞性試驗：1）酸破壞。取乳膏內容物，精密稱定（約相當于尿素50 mg），置100 mL 容量瓶中，精密加入2.0 mol/L 鹽酸1.0 mL，60 ℃放置2 h，放冷，精密加入2.0 mol/L NaOH 溶液1.0 mL，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過，取續濾液放至室溫。2）堿破壞。取乳膏內容物，精密稱定（約相當于尿素50 mg），置100 mL 容量瓶中，精密加入2.0 mol/L NaOH 溶液1.0 mL，60 ℃放置2 h，放冷，精密加入2.0 mol/ L 鹽酸1.0 mL，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過，取續濾液，放至室溫。3）氧化破壞。取乳膏內容物，精密稱定（約相當于尿素50 mg），置100 mL 容量瓶中，精密加入30%過氧化氫溶液1.0 mL，60 ℃放置2 h，放冷，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過，取續濾液，放至室溫。4）光照破壞。直接取未破壞的乳膏供試品溶液，于3 500 lx照射3 d，即得。5）高溫破壞。取乳膏內容物2 g，置頂空瓶密封后，105 ℃放置3 h，放冷，精密稱定（約相當于尿素50 mg），置100 mL容量瓶中，加乙醇50 mL，水浴加熱使尿素溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過，取續濾液，放至室溫。分別取上述破壞性試驗溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，結果尿素及縮二脲在酸、堿、氧化、光破壞條件下均較穩定，在高溫破壞條件下縮二脲含量明顯增加。色譜圖見圖3。

圖3 破壞性試驗高效液相色譜圖1.Biuret 2.Ureaa.Destroyed by high temperature b.Destroyed by acid c.Destroyed by alkali d.Destroyed by light e.Destroyed by oxidationFig.3 HPLC chromatogram of the destructive test

線性關系考察：取尿素對照品254.9 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為尿素貯備液，并定量稀釋成尿素質量濃度分別0.050 9，10.101 8，0.254 4，0.508 8，1.017 6 mg/mL的系列線性溶液；取縮二脲對照品11.57 mg，精密稱定，置500 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，作為縮二脲貯備液，并定量稀釋成縮二脲質量濃度分別為0.114 5，0.458 2，1.145 4，2.290 9，4.581 7 μg/ mL 的系列線性溶液。精密量取線性溶液各10μL，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以質量濃度（C）為橫坐標、待測組分峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果（n=5）Tab.1 Results of the linear relation test（n=5）

檢測限與定量限確定：取2.1 項下對照品溶液，逐級稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/ N）分別為3∶1和10∶1的質量濃度確定檢測限和定量限。結果尿素的檢測限和定量限分別為0.25，0.65 μg/ mL；縮二脲的檢測限和定量限分別為0.05，0.12μg/mL。

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6 次。結果尿素、縮二脲色譜峰峰面積的RSD分別為0.10%和0.46%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為201003），按2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件分別進樣測定。結果尿素和縮二脲的平均含量分別為100.60%和0.59%，RSD分別為0.32%和0.68%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取2.2 項下供試品溶液，分別于0，2，6，12，18，24 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果尿素、縮二脲色譜峰峰面積的RSD分別為0.19% 和0.25%（n=6），表明供試品溶液在24 h穩定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為201003）9份，精密稱定（每份約相當于尿素25 mg），尿素和縮二脲含量分別為100.60%和0.59%，分別置100 mL 容量瓶中，精密加入線性關系考察項下尿素及縮二脲貯備液各4，5，6 mL，平行3份，加乙醇50 mL，水浴加熱使溶解，放冷，加乙醇定容，搖勻，冰浴冷卻30 min，濾膜濾過，取續濾液，放至室溫，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.5 樣品含量測定

尿素含量：按2.1項下擬訂方法測定4個廠家59批次復方克霉唑乳膏中尿素的含量，與現行方法（2020 年版《中國藥典（二部）》）測得含量進行比較。結果見圖4。采用SPSS 19.0 統計學軟件分析2 種方法的檢驗結果，差異有統計學意義（t=6.265，P=0.000 001）。

圖4 不同方法測得尿素含量比較Fig.4 Comparison of the urea content determined by different methods

縮二脲含量：按2.1 項下擬訂方法測定4 個廠家59 批次復方克霉唑乳膏及3 個廠家3 批尿素原料藥中縮二脲的含量，結果見表3。

表3 復方克霉唑乳膏與尿素原料藥中縮二脲含量測定結果（%）Tab.3 Results of content determination of biuret in Compound Clotrimazole Cream and raw material of urea（%）

3 討論

3.1 色譜柱、檢測波長選擇

尿素和縮二脲在反相柱上保留弱，雖有文獻報道了使用氨基柱測定尿素［11］，但氨基柱柱效下降嚴重、使用壽命短、耐用性較差。HILIC 柱因其包含了親水、疏水、分子間作用（如靜電、偶極- 偶極、氫鍵）等在內的復合型原理，在大極性分子的分離、識別、改善峰形等方面優勢顯著［12-13］。試驗考察了HILIC 柱與鍵合酰胺基作為固定相的HILIC Amide 柱對尿素與縮二脲出峰和分離效果的影響。發現前者雖能滿足專屬性要求，但基線噪音大，影響了方法的靈敏度，而HILIC Amide 柱滿足專屬性和靈敏度要求，最終選擇HILIC Amide 柱。以流動相作為溶劑，于190～400 nm 波長范圍內測定了尿素與縮二脲對照品的紫外光譜圖，尿素和縮二脲均末端吸收最大，本研究中參考《美國藥典》尿素原料藥標準，選擇195 nm作為測定波長。

3.2 擬訂方法與現行方法測定結果分析

擬訂方法較現行方法測定結果偏低的原因是按現行方法檢驗過程中，克霉唑原料藥、克霉唑和尿素的有關物質等各種含氮有機化合物也會與對二甲氨基苯甲醛發生Ehrlich 反應。而2 種方法含量相差4%以上的產品均來自B廠家，可能原因為僅該廠家使用了含氮的輔料依地酸二鈉，依地酸二鈉中的叔胺基與對二甲氨基苯甲醛發生了顯色反應。可見，現行方法不能準確反映藥品的實際質量，修訂后的尿素含量測定方法更科學、有效和可控。

3.3 縮二脲的形成機制

尿素對熱不穩定，100 ℃以上可生成副產物縮二脲［14］，這也與高溫強制降解試驗結果相吻合，同時縮二脲的生成與溫度和停留時間成正比［15］。而復方克霉唑乳膏生產中均使用了高溫（85～90 ℃）、長反應時間（2～3 h）的油水乳化工藝，故生產工藝中若溫度控制不嚴格也有可能產生工藝雜質縮二脲。

3.4 縮二脲結果分析

B 廠家提供的1 批尿素原料藥中縮二脲含量為0.01%，該廠家乳膏中的縮二脲含量在0.01%～0.58%，離散程度大，可能原因為該廠家尿素原料藥中的副產物縮二脲含量差異大或乳膏生產過程中溫度控制不嚴格生成了工藝雜質縮二脲。A廠家乳膏中縮二脲含量均較高，與其提供的原料藥中縮二脲含量較高相吻合。C 廠家提供的1 批尿素原料藥中縮二脲含量為0.10%，而其乳膏中縮二脲含量均低于0.10%。可見，縮二脲含量低的尿素原料藥和穩定的生產工藝可使乳膏中的縮二脲控制在較低水平。

3.5 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、專屬性強、結果準確可靠，可用于復方克霉唑乳膏中尿素及其縮二脲的質量控制，同時也為尿素原料藥和以尿素為原料藥的制劑的質量控制提供了參考。