預知子總皂苷大孔樹脂分離純化工藝優化及抗氧化活性研究*

楊 晨，武正華，石文清，吳江平，范國榮△

（1. 安徽中醫藥大學藥學院，安徽合肥 230012； 2. 上海交通大學附屬第一人民醫院，上海 200940；3. 同濟大學附屬上海市第四人民醫院，上海 200434）

預知子Akebiae Fructus為木通科植物木通Akebia quinata（Thunb.）Dence、三葉木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koidz. 或白木通Akebia trifoliata（Thunb.）Koide.var.austrlis（Diels）Rehd. 的干燥近成熟果實，又稱“八月瓜”“八月炸”，廣泛分布于江蘇、浙江、安徽等地。預知子氣微香，味苦，性寒，歸膽、肝、胃、膀胱經，具有疏肝理氣、活血止痛、散結、利尿等功效［1］。現代藥理學研究表明，其主要含有三萜皂苷、綠原酸、黃酮等成分［2-3］，其中三萜皂苷作為預知子的主要成分，具有抗炎［4-5］、抗菌［6-7］、抗抑郁［8-9］、抗癌［10-12］等活性。另外，預知子中富含多種人體生長所需的營養成分，成熟后味甜。四川、云南等地將其作為水果食用，因其含有較多種子，部分地區也用其種子榨油，具有很好的開發前景［13］。隨著三葉木通人工種植技術的不斷成熟，以三葉木通為原料的產品開始進入大眾視野，但其加工的產品還不能滿足市場需求［14］。大孔樹脂作為一類由有機高分子聚合物形成的具有網狀結構的圓形吸附材料，具有成本低、無污染、提取效率高、可再生等優點，被廣泛應用于化工、醫藥、食品等行業［15］。越來越多證據表明，氧化應激反應與人類多種疾病關系密切，故通過補充天然的抗氧化劑來平衡生物系統中的活性氧（ROS）水平具有重要意義［16］。而目前對預知子總皂苷抗氧化活性的研究較少，故本研究中使用大孔樹脂對預知子提取物中三萜皂苷進行分離純化，并研究其總皂苷的抗氧化活性，以期為預知子的藥效物質基礎及產品的深度開發提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

50 Conc型紫外分光光度計（美國Varian公司）；TS-1型搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AUW220D型電子天平（日本Shimadzu 公司，精度為十萬分之一）；RS-FS-1411型粉碎機（合肥榮事達電子電器集團有限公司）；R5005K2D 型旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；pH計（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）。

1.2 試藥

預知子（上海萬仕誠國藥制品有限公司，批號為20210728-2）；齊墩果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110709 - 202109，含量以95.8 %計）；D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS-7，ADS - 8，S - 8，D4020 型大孔樹脂（鄭州和成新材料科技有限公司，批號為HC220619）；2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH，北京華邁科生物技術有限公司，批號為D310202，含量不低于97%）；2，2 - 聯氮- 二（3 - 乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，上海源葉生物科技有限公司，批號為A02GS143434，含量不低于98%）；總抗氧化能力檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號為BC1310）；過硫酸鉀、香草醛、高氯酸、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 預知子提取物溶液制備

取預知子，粉碎，過2號篩，按比例1∶20（m/V）加入85%乙醇，浸泡60 min，85 ℃回流提取3 次，每次1.5 h，濾過，取上清液，減壓濃縮去乙醇，即得預知子提取物。加入適量水，配制質量濃度為100～800 mg/mL 的預知子提取物溶液，備用。

2.2 總皂苷含量測定［17］

取齊墩果酸對照品5.10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對照品溶液；以甲醇為空白對照。精密量取上述對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，揮盡甲醇，精密加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL和高氯酸0.4 mL，充分搖勻，60 ℃水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5 mL，搖勻，于540 nm 波長處測定吸光度。以對照品溶液質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y=0.008X-0.010 6（R2=0.999 5，n= 6）。結果表明，總皂苷（以齊墩果酸計）質量濃度在9.11～54.64μg/mL范圍內與吸光度線性關系良好。

2.3 大孔樹脂預處理

分別稱取一定量的D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS - 7，ADS - 8，S - 8，D4020 型大孔樹脂，在無水乙醇中浸泡24 h 后用純水洗至無醇味，依次用5 倍體積4%鹽酸溶液、純水、4%氫氧化鈉溶液淋洗，用純水洗至中性，晾干，得各型號干樹脂備用。

2.4 大孔樹脂型號篩選

靜態吸附試驗：稱取D101，AB-8，D1300，HPD300，HPD400，HPD500，ADS - 7，ADS - 8，S - 8，D4020 型干樹脂各1.0 g，加入20 mL 質量濃度為400 mg/mL 的預知子提取物溶液，置100 mL 具塞錐形瓶中，密封，置搖床上（轉速為150 r/min）振蕩24 h，充分吸附，濾過，取一定體積吸附后的液體，按2.2項下方法測定濾液中總皂苷的含量，并計算不同型號大孔樹脂對預知子總皂苷的吸附率，吸附率（%）=［（C0-C1）V1/W］× 100%。式中，C0為初始總皂苷質量濃度，C1為吸附后上清液中總皂苷質量濃度，V1為上樣體積，W為樹脂質量（干重）。詳見表1。

表1 不同型號大孔樹脂對預知子總皂苷的靜態吸附和靜態解析試驗結果Tab.1 Static adsorption and analytical comparison of total saponins of Akebiae Fructus by different macroporous resins

靜態解析試驗：將上述靜態吸附后的10 種樹脂水洗后晾干，分別置100 mL 具塞錐形瓶中，分別加入80%乙醇溶液20 mL，密封，置搖床（轉速為150 r/min）振蕩12 h，使其充分解析，取一定量吸附后液體，按2.2 項下方法測定總皂苷吸光度，并計算不同型號大孔樹脂對預知子總皂苷的解吸附率與解吸附效果，解吸附率（%）=C2CV/W×100%，解吸附效果（%）=解吸附率/吸附率×100%。式中，C2為解析濃度，CV為解析體積。詳見表1。可見，S-8 型大孔樹脂對預知子總皂苷的吸附率、解吸附率與解吸附效果均較其他樹脂高，故選擇S-8型樹脂用于后續預知子總皂苷的分離與純化。

2.5 上樣條件考察

上樣液pH：精密量取8 份5 mL 預處理過的S-8 型大孔樹脂，加入pH 分別為2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5 的預知子提取物溶液15 mL，置搖床（轉速為150 r/min）振蕩12 h，測定吸附前后溶液中總皂苷的含量。由圖1 可知，pH 為2.5 時吸附率最高（52.72%），故最佳上樣液pH 為2.5。這可能是因為皂苷類化合物中含有羧基，在酸性條件下較穩定。由于三萜皂苷中有連接糖鏈，pH 過低會導致其水解成苷元，故上樣液pH 最終選擇2.5。

圖1 上樣液pH對總皂苷吸附效果的影響Fig.1 Effect of pH of the sample solution on the adsorption effect of total saponins

吸附等溫線：精密量取8 份預處理過的S - 8 型大孔樹脂5 mL，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入質量濃度為100～800 mg/mL 的預知子提取物溶液，于0，25，50 ℃水浴搖床恒溫振蕩12 h，測定吸附前后溶液中總皂苷的含量，并計算平衡吸附量（Qe），Qe=（C0-Ce）V/W。式中，C0為初始總皂苷質量濃度，Ce為吸附平衡后預知子總皂苷濃度，V為溶液體積。由圖2 可知，樹脂平衡吸附量隨提取物濃度的增大而增加，隨溫度的升高而降低，表明低溫有助于樹脂的吸附，故S-8型樹脂對預知子的吸附屬放熱過程。

圖2 S-8型大孔樹脂對預知子提取物的吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherm of S-8 macroporous resin on the Akebiae Fructus extract

吸附等壓線：精密量取預處理過的S-8 型大孔樹脂5 mL，分別置100 mL具塞錐形瓶中，加入質量濃度為200 mg/mL預知子提取物溶液15 mL，25 ℃下水浴搖床（轉速為150 r/min）恒溫振蕩，每10 min 取出1 個錐形瓶，至濃度基本不變時停止，測定總皂苷含量，并計算瞬時吸附量（Qt），Qt=（C0-Ct）V/W。式中，Ct為t時刻總皂苷濃度。由圖3可知，0～40 min內吸附量隨時間的增加而快速上升，40～120 min內吸附率逐漸減緩，120 min后逐漸趨于平衡，為避免浪費提取液，故選擇靜態吸附2.5 h后進行洗脫。

上樣量：取預處理后的S-8 型樹脂40 mL，濕法緩慢裝入吸附柱中，以一定質量濃度的預知子提取物溶液上樣，保持流速為1.0 mL/min，每20 mL 收集1份流出液，測定總皂苷質量濃度，繪制泄露曲線。當流出液中該成分質量濃度為上樣液的1/10 時，認為達到泄露點。由圖4可知，第5份流出液中總皂苷質量濃度急劇上升，并超過上樣液的1/10，故確定最大上樣量為80 mL，即上樣量與樹脂體積比為2∶1（V/V）。

圖4 S-8型大孔樹脂對預知子提取物的泄露曲線Fig.4 Leakage curve of S-8 macroporous resin on the Akebiae Fructus extract

2.6 洗脫條件考察

洗脫液體積分數：取預處理好的S-8 型大孔樹脂20 mL，濕法裝柱，取40 mL pH 為2.5 的預知子提取物溶液（質量濃度為200 mg/mL），以1 mL/min 的流速上樣，動態吸附2.5 h 后用6 BV 體積蒸餾水除雜，依次用3 BV 10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液，于540 nm 波長處測定吸光度，計算總皂苷洗脫量。由圖5 可知，3 BV 50%乙醇可洗脫大部分皂苷。綜合考慮對預知子總皂苷的最大富集效果及節約溶劑，分別選用6，9，12 BV 體積的40%，50%，60%乙醇溶液進行響應面試驗，選擇最佳洗脫工藝。

圖5 不同乙醇體積分數洗脫劑下總皂苷的洗脫量Fig.5 Elution amount of total saponins under different volume fractions of ethanol as eluents

Box - Behnken 響應面試驗考察洗脫工藝：影響洗脫工藝的因素主要包括洗脫劑體積（因素A）、洗脫劑體積分數（因素B）、洗脫流速（因素C）。由于洗脫流速越大，洗脫劑與樹脂作用時間越短，則需要更多的洗脫劑將物質洗脫下來，綜合洗脫效果與生產效率，選擇0.5，1.0，1.5 mL/min進行響應面試驗。采用三因素三水平響應面法，取40 mL pH為2.5、生藥質量濃度為200 mg/mL的預知子提取物溶液，以1.0 mL/ min 的流速上樣，按2.2 項下方法測定總皂苷吸光度。響應面試驗因素與水平見表2，試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。采用Design Expert 10.0.1 軟件分析，以洗脫劑體積、洗脫劑體積分數、洗脫流速為響應變量，總皂苷回收率為響應值，進行回歸擬合分析，得模型Y= 10.276 35A+6.845 28B+37.237 37C-0.103 21AB-0.820 19AC-0.059156BC-0.18725A2-0.049331B2-12.29081C2-191.552 93。由表4 可知，其中A，B，B2的影響極顯著（P＜0.01），AB，C2的影響顯著（P＜0.05）；由F值可知，各因素對總皂苷回收率的影響程度由大至小為洗脫劑體積分數＞洗脫劑體積＞洗脫流速。繪制各影響因素相互作用對預知子總皂苷回收率影響的三維響應面圖，結果見圖6。可知，響應面優化條件為，洗脫劑體積9.00 BV，洗脫劑體積分數59.80%、洗脫流速1.12 mL/min。考慮到試驗的可操作性，決定采用9 BV 60%乙醇溶液為洗脫劑，洗脫流速為1.0 mL/min，進行驗證試驗。

表2 Box-Behnken響應面試驗因素與水平Tab.2 Factors and levels of the Box-Behnken test

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the Box-Behnken test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of the analysis of variance

圖6 各因素相互作用對預知子總皂苷回收率影響的三維響應面圖A.Volume of eluent-Volume fraction of eluent B.Volume of eluent-Flow rate of elutionC.Volume fraction of eluent-Flow rate of elutionFig.6 Three dimensional response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the recovery rate of total saponins from Akebiae Fructus

驗證試驗：精密量取S-8 型大孔樹脂20 mL，加入pH 為2.5 的預知子提取物溶液40 mL，以1.0 mL/ min的流速上樣，9 BV 60%乙醇洗脫（流速為1.0 mL/min），平行3 份。結果預知子總皂苷轉移率分別為76.09%，76.64%，76.59%，平均為76.44%（RSD為0.40%），與預測值77.21%相差-0.77%，表明該工藝穩定、可靠。

2.7 預知子總皂苷體外抗氧化活性測定

DPPH 自由基清除能力測定：參考文獻［18］，用95%乙醇溶液配制0.1 mmol/ L 的DPPH 溶液（臨用現配）。吸取0.4 mL乙醇與0.2 mL DPPH 溶液，混勻，作為空白對照組（A0）；吸取0.4 mL 不同濃度總皂苷樣品溶液與0.2 mL 無水乙醇，混勻，作為樣品對照組（A1）；吸取0.4 mL不同濃度總皂苷樣品溶液與0.2 mL DPPH 溶液，混勻，作為試驗組（A2）。37 ℃避光孵育30 min，于517 nm 波長處測定吸光度。DPPH 自由基清除率（%）=［1-（A2-A1）/A0］×100%。結果表明，總皂苷樣品溶液的質量濃度在0.03～1.67 mg/mL 范圍內與DPPH 自由基清除率量效關系良好。得擬合方程Y= 0.003 5X-0.009 1（R2=0.994 6），半數抑制濃度（IC50）為0.15 mg/mL。

ABTS 自由基清除能力測定：參考文獻［19］，吸取7mmol/LABTS溶液與4.9mmol/L 過硫酸鉀溶液，按1∶1（V/V）混合，室溫避光反應12～16 h，使用前用去離子水稀釋，于734 nm波長處測定吸光度為0.70±0.02。吸取0.5 mL ABTS 溶液，加0.1 mL 去離子水，混勻，作為空白對照組（A0）；吸取0.5 mL ABTS 溶液與過硫酸鉀溶液，混勻，加0.1 mL 不同濃度總皂苷溶液，作為試驗組（A1）。室溫避光反應20 min，于734 nm 波長處測定吸光度。ABTS 自由基清除率（%）=［（A0-A1）/A0］×100%。得擬合方程Y=0.318 5X+0.027 3（R2=0.998 8），IC50為1.54 mg/mL，表明總皂苷樣品溶液質量濃度在0.33～2.67 mg/ mL 范圍內與ABTS 自由基清除率量效關系良好。

總抗氧化能力檢測：按總抗氧化能力檢測試劑盒說明書操作，將硫酸亞鐵標準溶液用蒸餾水稀釋為不同梯度濃度，繪制標準曲線，得回歸方程Y=4.421 8X+0.001 1（R2=0.999 3），表明硫酸亞鐵濃度在0.001 56～0.05μmol/mL范圍內線性關系良好。按7∶1∶1的比例將試劑1、試劑2、試劑3混合成混合液，吸取混合液0.9 mL，加0.12 mL 蒸餾水作為A空白，加0.3 mL 樣品與0.12 mL蒸餾水作為A測定。按公式ΔA測定=A測定-A空白計算ΔA測定，由回歸方程可知預知子提取物濃度，計算總抗氧化能力。總抗氧化能力（μmol/mL）=XV反總/V樣。式中，X為樣本濃度，V反總為反應總體積，V樣為反應中樣本體積。按藥材量計算質量濃度為80 mg/mL 的預知子總皂苷的總抗氧化能力為4.86μmol/mL。

3 討論

三萜皂苷為預知子中的主要成分，藥理活性廣泛。本研究中首次利用大孔樹脂分離純化預知子中的總皂苷，并通過考察10 種不同極性的大孔樹脂對預知子總皂苷的吸附率及解吸附率，篩選出S-8 型大孔樹脂用于分離純化預知子總皂苷；通過單因素試驗結合Box-Behnken 響應面試驗確定了上樣及洗脫工藝，確定了以上樣液質量濃度為200 mg/ mL，上樣液體積與樹脂體積比為2∶1（V/V），pH 為2.5，以9 BV 60%乙醇溶液洗脫，流速為1.0 mL/ min 為條件進行分離純化，且預測值和驗證結果相符，表明該工藝穩定可靠。

預知子作為一種藥食同源的中藥，由于目前對其生物活性及藥理作用機制尚不明確，導致其應用并不廣泛。而DPPH 和ABTS 自由基清除及總抗氧化能力由于方法簡單、快速、經濟、可靠，被廣泛應用于天然產物抗氧化活性的評價中［20］。本研究結果表明，預知子總皂苷具有一定抗氧化能力，可為功能性食品開發及后續有關預知子中三萜皂苷的研究提供參考。