四種致瀉性大腸桿菌多重PCR檢測方法的建立及在大熊貓上的應用

王路才，蘇小艷，張煥容，劉頌蕊，燕 霞，楊 梅，李明喜*

（1.成都大熊貓繁育研究基地，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，四川 成都 610081；2.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川 成都 610041）

大腸桿菌（E.coli）屬革蘭氏陰性短桿菌，為條件致病菌，在自然條件下普遍存在，僅有致病性大腸桿菌具有致病性，可引起人和動物發生以腹瀉癥狀為主的疾病。根據不同的生物學特性，將致病性大腸桿菌分為5 類：腸道致病性大腸桿菌（EPEC）、腸道侵襲性大腸桿菌（EIEC）、產腸毒素大腸桿菌（ETEC）、腸道集聚性大腸桿菌（EAEC）和腸道出血性大腸桿菌（EHEC）［1］。

自1983年起，陸續有大熊貓感染致瀉性大腸桿菌的報道，嚴重者甚至導致死亡［2-3］。多重PCR檢測在轉基因鑒定、食品檢測、病原體檢測、腫瘤診斷等領域已成功運用［4-8］，具有快速、靈敏、準確等優點。本研究擬針對escV、stx1、stx2 和bfpB 毒力基因建立檢測EPEC 和EHEC 的多重PCR 體系，針對lt、sth、astA、aggR 和pic毒力基因建立檢測ETEC 和EAEC 的多重PCR 體系，為大熊貓腸道腹瀉性疾病提供及時、可靠的診斷結果，指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 菌株 ETEC（CICC10667）、EAEC（CICC24186）、EHEC（CICC24187）、EPEC（CICC24189）均為標準菌株，購自CICC 中國食品發酵工業研究院有限公司和中國工業微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌質控菌株ATCC25922、肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、盲腸腸球菌、巴氏鏈球菌、摩氏摩根菌，均由四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA 提取試劑盒，2×Taq PCR MasterMix，核酸染料；PCR 儀，核酸電泳儀，凝膠成像系統。

1.3 引物的設計與合成 按食品安全國家標準（大腸桿菌GB 4789.6-2016）中EPEC 和EHEC 的escV、stx1、stx2、bfpB 基因序列設計引物，根據ETEC 和EAEC 的lt、sth、astA、aggR、pic基因序列設計引物，引物序列送至生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.4 細菌DNA的提取 將保存的EPEC、EHEC、ETEC、EAEC 標準菌株分別接種于LB 營養肉湯培養基中，37 ℃振蕩培養過夜后，取菌懸液1 mL，按照DNA 提取試劑盒說明書提取DNA。根據公式計算相應拷貝數。

1.5 單一PCR擴增及反應條件優化 單一PCR反應體系為25 μL，對單一PCR的引物添加量和退火溫度進行優化，引物濃度設為10 μmol/L，引物添加量優化范圍為0.1～2.0 μL，退火溫度優化范圍為54～64 ℃。優化結束后，選取最優反應條件進行單一PCR 擴增，PCR 產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，并將其余產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.6 多重PCR 擴增及反應條件優化 在單一PCR的基礎上，對多重PCR方法進行引物和退火溫度優化。EPEC 和EHEC 多重PCR 反應中，引物添加量優化為0.1～2.0 μL，退火溫度優化為57～65 ℃。ETEC 和EAEC 多重PCR 反應中，引物添加量優化為0.1～2.0 μL，退火溫度優化為55～63 ℃。

1.7 多重PCR 特異性試驗 分別以EPEC 標準菌株、EHEC 標準菌株、ETEC 標準菌株、EAEC 標準菌株、金黃色葡萄球菌標準菌株、大熊貓源肺炎克雷伯菌、大熊貓源多殺性巴氏桿菌、大熊貓源奇異變形桿菌、大熊貓源綠膿桿菌、大熊貓源糞腸球菌、大熊貓源鮑曼不動桿菌、大熊貓源盲腸腸球菌、大熊貓源巴氏鏈球菌、大熊貓源摩氏摩根菌的DNA為模板進行多重PCR擴增，評估所建立的多重PCR方法的特異性。

1.8 多重PCR 敏感性試驗 提取EPEC 標準菌株、EHEC 標準菌株、ETEC 標準菌株、EAEC 標準菌株的DNA后，將DNA濃度調整為200 ng/mL，再用滅菌ddH2O 進行10 倍系列稀釋成6 個梯度濃度，將每組各個稀釋度等比例混合，按照1.6建立的多重PCR方法擴增，檢測多重PCR方法的敏感性。將4 種致瀉性大腸桿菌菌液進行10 倍系列稀釋成6 個梯度濃度，將每組各個稀釋度等比例混合，檢測多重PCR方法對菌液的敏感性。

1.9 多重PCR重復性試驗 利用優化后的多重PCR 方法以相同的條件進行重復性試驗，重復8次，每次間隔一周。以此驗證本次建立的多重PCR方法的重復性和穩定性。

1.10 多重PCR 對人工模擬糞便污染樣品的檢測 EPEC標準菌株、EHEC標準菌株、ETEC標準菌株、EAEC 標準菌株過夜培養后調整濃度為2.0×101CFU/mL，取1 mL 混合菌液加入0.1 g 健康大熊貓糞便中進行糞便污染樣本模擬，并設為試驗組，設置生理鹽水（替換菌液）為陰性對照組。提取糞便樣本DNA，用所建立的多重PCR方法和單一PCR 方法對10 份人工模擬糞便污染樣品進行檢測，比較兩種方法的檢測結果，并計算兩者的符合率。

1.11 多重PCR對臨床腹瀉糞便樣本的檢測 采集大熊貓的腹瀉糞便樣本，增菌培養后提取DNA，進行大腸桿菌通用毒力基因phoA 檢測，再將檢測為陽性的DNA 模板作為多重PCR 的模板進行致病型鑒定檢測。采用本試驗建立的多重PCR方法和標準單一PCR方法對110份臨床大熊貓糞便樣品進行檢測，比較兩種方法的檢測結果，并計算兩者的符合率。

2 結果

2.1 單一PCR 方法的建立 經過引物濃度、退火溫度等條件摸索，ETEC、EAEC、EHEC 和EPEC四種菌單一PCR 的最佳擴增體系和反應條件見表1。

表1 單一PCR最佳反應體系及條件

2.2 多重PCR擴增及反應條件優化結果 經過引物濃度、退火溫度等條件摸索，結果得出EPEC和EHEC 多重PCR 反應的最佳體系為：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板量均為2.0 μL，escV、stx1、stx2 引物（10 μmol/L）量各0.2 μL，bfpB為0.4 μL，滅菌ddH2O 為8.5 μL；最佳退火溫度為61 ℃45 s（表2 和圖1A）。ETEC 和EAEC 多重PCR 反應的最佳體系為：2×Taq PCR MasterMix12.5 μL，escV、stx1、stx2 引物（10 μmol/L）量各0.2 μL，bfpB為0.4 μL，DNA模板量均為2.0 μL，滅菌ddH2O 為8.5 μL；最佳退火溫度為59 ℃ 30 s（表3和圖1B）。

表2 EPEC和EHEC多重PCR反應條件

表3 ETEC和EAEC多重PCR反應條件

2.3 特異性試驗結果 多重PCR 方法特異性檢測結果顯示，EPEC 和EHEC 多重PCR 僅在escV（544bp）、stx1（244bp）、stx2（324bp）和bfpB（910bp）基因擴增為陽性；ETEC和EAEC多重PCR僅在astA（102 bp）、sth（171 bp）、lt（655 bp）、aggR（400 bp）和pic（1 111 bp）基因擴增為陽性。兩組多重PCR對肺炎克雷伯菌、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、鮑曼不動桿菌、盲腸腸球菌、巴氏鏈球菌、摩氏摩根菌均未觀察到擴增條帶，表明該方法的特異性較強。

2.4 敏感性試驗結果 在本試驗建立的多重PCR 方法中，EHEC 和EPEC 的最低DNA 檢測限為2.71×104拷貝/μL（圖2A），EAEC 的最低DNA檢測限為3.23×104拷貝/μL，ETEC 的最低檢測限為3.23×103拷貝/μL（圖2B）。菌液檢測中，EPEC和EHEC的最低檢測限為1.85×104CFU/mL，ETEC的最低檢測限為2.9×103CFU/mL，EAEC 的最低檢測限為2.62×104CFU/mL。以上結果表明該方法具有較高的敏感性。

2.5 重復性試驗結果 將提取的細菌基因組DNA利用建立好的EHEC和EPEC多重PCR方法與ETEC 和EAEC 多重PCR 方法在不同時間進行8次重復擴增。結果表明每次多重PCR結果都能擴增出相應的目的片段，說明該方法的穩定性、重復性好。

2.6 人工模擬糞便污染樣品的檢測結果 采用本試驗建立的兩組多重PCR分別檢測，結果都能擴增出相應的目的條帶，說明該方法對人工模擬糞便污染樣品的檢測結果較為準確。

2.7 臨床腹瀉糞便樣品的檢測結果 臨床樣品檢測結果顯示，均檢出phoA 陽性（圖3），將phoA陽性菌株分別用EHEC 和EPEC 多重PCR 方法、ETEC 和EAEC 多重PCR 方法進行4 種致 瀉性 大腸桿菌的檢測，結果檢出2 個樣品的escV 基因呈陽性，目的條帶為544 bp，其余擴增結果均為陰性（圖4A）。通過標準單一PCR 進行驗證，確證escV 基因在544 bp 處擴增出條帶（圖4B），且通過測序再次驗證了結果。本試驗建立的多重PCR 與標準單一PCR 的陽性符合率為100%，表明兩組多重PCR 方法均可用于臨床樣品的檢測。

圖3 部分臨床糞便樣本phoA基因擴增結果

圖4 臨床糞便樣品的多重PCR（A）和單一PCR（B）擴增結果

3 討論

大腸桿菌作為一種常見的條件致病菌，在大熊貓臨床糞便樣本中普遍存在。EPEC、EHEC、ETEC 和EAEC 可引起大熊貓以腹瀉癥狀為主的腸道疾病［9］。本研究建立了這4種不同致病性病原的多重PCR檢測體系，結果證明該檢測體系具有操作簡單、快速、靈敏、準確等優點。

多重PCR 在擴增中的特異性和敏感性受到多方面因素的影響，本研究選用9 對毒力基因分別建立了2 組多重PCR，這9 對毒力靶標基因的分子質量大小范圍不等，可以使目的片段分布在Marker 不同標尺大小的區域，不易造成對目的片段的誤判。對于多重PCR 反應結果影響最大的因素是反應體系的退火溫度和引物量。通過引物添加量的優化，可以避免引物問題導致錯配和非特異性擴增［10］。Taq酶的添加量過低會造成產量降低，過高會導致非特異性擴增［11］。退火溫度的優化可以提高PCR 擴增效率，在合適的范圍內，較高的退火溫度的特異性較強［12］。延伸時間在多重PCR里與酶的含量有一定的關系，在合適范圍內增加延伸時間可以增加產物的量。故本試驗對退火溫度、引物添加量、酶添加量和延伸時間進行了反復多次優化，成功建立了2 組多重PCR體系，可以有效地檢測出樣本中的病原菌。張鐵男等［13］的研究結果顯示，ETEC 的檢測下限為2.6×104CFU/mL，本試驗方法的檢測下限為2.9×103CFU/mL，相比之下用本試驗建立的方法檢測ETEC更為敏感。

4 結論

本研究建立的2組多重PCR檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和重復性，在臨床樣本檢測中提高了檢出效率，為大熊貓種群4 種致瀉性大腸桿菌感染的快速診斷及流行病學調查提供了技術支撐。