合成生物學助力鏈霉菌天然產物農藥創制與產業化

潘明慧, 楊 雪, 杜國忠, 李曉瑾, 張艷艷,向文勝,2*, 李珊珊*

(1. 中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193；2. 東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030)

中國的生態環境多樣,物種資源豐富,以9%的耕地和6%的淡水資源養活了世界上近1/5的人口,是名副其實的農耕大國。然而,農業生產中常伴隨著嚴重繁復的病、蟲、草危害,導致糧食損失可高達每年總產量的1/3[1]。農藥是防控病蟲草害、提高糧食單產最有效的手段,是保障糧食增產豐收的重要支柱。近年來,用于農業病蟲草害防治的化學農藥使用量呈現負增長趨勢,然而,病蟲草害抗藥性、農產品農殘超標以及農區環境污染等問題,仍給國家糧食安全、農產品質量安全和生態安全帶來了隱患。2006年,我國提出了“公共植保、綠色植保”的理念,開啟了農作物病蟲草害綠色防控新征程;2018年以來,藥肥“兩減”“糧豐”國家重點專項和一系列政策的扶持,進一步推動了農業病蟲草害綠色防控理念;2021年,農業農村部印發《“十四五”全國農業綠色發展規劃》,明確優先發展生物農藥,走農業綠色發展之路;2021年9月,中共中央政治局就加強我國生物安全建設進行第三十三次集體學習,習近平總書記強調:要加快推進生物科技創新和產業化應用,集成推廣生物防治、綠色防控技術和模式,促進人與自然和諧共生,為我國農作物病蟲草害防控和生物農藥的發展指明了方向。

微生物天然產物農藥主要是以微生物活性次級代謝產物為有效成分的農藥。鏈霉菌Streptomyces以能夠產生大量活性次級代謝產物而著稱,是天然產物農藥的重要工業生產菌。鏈霉菌天然活性產物可用作農用殺菌劑、殺蟲劑、除草劑和植物生長調節劑,因具有高效、低毒和環境友好等特點,在農作物病蟲草害綠色防控中占據重要地位。截至2022年7月,天然產物農藥(主要指農用抗生素)在生物農藥登記的活性成分總數中占比超60%,總體產量也占到生物農藥總產量的2/3。其中,阿維菌素、井岡霉素、春雷霉素等相關產品登記超3 500個[2]。盡管如此,微生物天然產物農藥研發在菌株資源挖掘、新活性化合物發現及產業化進程中仍面臨若干挑戰,這也對微生物天然產物農藥的創制提出了新的要求。

合成生物學是一門交叉學科,其以工程化為理念,根據需求對生物體進行理性設計、改造乃至重新合成,創建賦予非自然功能的“人造生命”[3]。合成生物學的核心內涵是“會聚”,它會聚了科學研究帶來的“發現能力”,工程學理念帶來的“建造能力”,以及顛覆性技術帶來的“發明能力”,從而全面提升社會的“創新能力”[4]。在技術飛速發展的時代,如何利用合成生物學技術助力農作物病蟲草害綠色防控是推動農業科技創新、保障國家糧食安全的重要研究內容[5]。本文總結了合成生物學助力鏈霉菌天然產物農藥挖掘、改造及工程化的研究現狀和應用進展,為加快農作物病蟲草害綠色防控進程,保障國家糧食安全、生態安全和農產品質量安全,筑牢國家生物安全屏障提供參考。

1 鏈霉菌天然產物農藥的發展和應用

放線菌門是細菌最大的門之一,廣泛分布于土壤環境中,可以有效改善土壤質量和肥力[6]。同時,放線菌門的鏈霉菌屬細菌是天然產物藥物的重要生產者,其產生的若干天然產物在促進植物生長發育以及病蟲草害防治方面均具有良好的活性與巨大的應用價值,如阿維菌素(avermectin)、井岡霉素(jinggangmycin)和春雷霉素(kasugamycin)已經成為廣泛應用于農作物病蟲草害防治的天然產物農藥。

鏈霉菌天然產物農藥從功能上主要劃分為殺菌劑(bactericide)、殺蟲劑(insecticide)、除草劑(herbicide)和植物生長調節劑(plant-growth regulator,PGR)(圖1),在結構上包括聚酮類、多肽類、萜類等主要骨架。我國天然產物農藥的研究迄今有70多年的發展歷程,成功開發應用了多種農藥品種,對我國鏈霉菌天然產物農藥及其產生菌、應用現狀總結詳見表1。自20世紀50年代以來,包括滅瘟素-S(blasticidin-S)、春雷霉素、井岡霉素、農抗120(agro-antibiotic 120)、寧南霉素(ningnanmycin)、中生菌素(zhongshengmycin)、武夷菌素(wuyiencin)等多種殺菌劑先后問世,其中井岡霉素是我國應用面積最廣的天然產物農藥之一,廣泛用于水稻紋枯病、棉花立枯病和麥類紋枯病等的防治[7]。1975年,具有高效殺蟲活性的新型生物殺蟲劑阿維菌素被發現,日本科學家大村智和美國科學家威廉 C·坎貝爾作為首次發現者共同獲得2015年諾貝爾生理或醫學獎。1984年,阿維菌素在中國首次被分離鑒定,至今仍廣泛應用于農業、畜牧業和醫藥行業。此外,阿維菌素B1母體結構的半合成衍生物甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(簡稱甲維鹽)對鱗翅目害蟲的殺蟲活性增強,是一種新型高效的殺蟲劑、殺螨劑[8]。微生物除草劑的研究較農用殺菌劑、殺蟲劑相對薄弱,近3年無微生物除草劑獲批登記[9]。目前微生物除草劑研發應用方面利用最廣的是真菌,如1963年研發的微生物菌劑“魯保一號”對菟絲子有良好防效,是我國首個大規模應用的微生物除草劑[9]。此外,雙丙氨膦及其衍生物草銨膦是由鏈霉菌(產綠色鏈霉菌StreptomycesviridochromogenesDSM 40736和吸水鏈霉菌StreptomyceshygroscopicusATCC 21705)產生的非選擇性內吸輸導型高效除草劑,能夠抑制光合作用過程中的光合磷酸化作用,相關產品廣泛用于防除果園、苗圃、橡膠園等園區內多種一年生和多年生禾本科雜草及闊葉雜草[10]。植物生長調節劑的研究多數集中在植物內源激素,如赤霉素類、脫落酸類和細胞分裂素類等,也有研究者在植物致病菌中發現了植物外源激素,如冠霉素(coronatine,COR)[11]和生物刺激劑維大力(VDAL)[12]等。鏈霉菌發酵液中也發現有促進植物生長的生長素,如吲哚乙酸等[13-15],但能作為新農藥開發應用的新活性天然產物鮮有報道。向文勝團隊從藥用植物重樓Parispolyphylla的根際土壤中篩選到一株鏈霉菌Streptomycessp. NEAU6,在其活性代謝產物中分離得到一種核苷類似物——谷維菌素(guvermectin)。利用該活性化合物浸種,可以促進水稻根系和胚芽的生長、分蘗和早熟,增強水稻的抗病性和抗逆性,提高出米率[16],并促進玉米在高溫脅迫下的生長和提高耐受性[17],誘導擬南芥早期開花[18]。2021年,谷維菌素在國內成功注冊為新型天然植物生長調節劑(原藥登記證號:PD20212929),并技術轉讓于遠大生科植物保護(上海)有限公司,相關產品“福余有佳?”擬上市。

圖1 鏈霉菌代謝產物農藥活性成分示例與分類Fig.1 Examples and classification of the natural product biopesticides produced by Streptomyces

2 合成生物學在天然產物研究中的重要價值

《禮記·大學》有言:致知在格物,物格而后知至。合成生物學的興起和飛速發展開創了從“格物致知”向“造物致用”的理念轉換,最終從工程學的研究角度落實到產業化。合成生物學以多學科交叉的相融性,實現從分析、認識、定量、預測到人工設計合成生命的科學跨越,在材料、能源等社會經濟重要領域以及醫藥、農業、食品等人民健康相關領域都取得了顛覆性進展,帶來了生命科學領域的第三次革命[41]。聚焦天然產物相關研究,合成生物學分別在高效底盤細胞的優化、植物源天然產物的微生物細胞工廠搭建、微生物活性次級代謝產物挖掘,以及代謝途徑優化改造等方面推進了天然產物高效生物制造。

底盤細胞的選擇及改造是實現利用合成生物學方法生產天然產物的基礎,研究者們通過基因組最小化、抗逆性調整、代謝需求改造、基因編輯工具開發等,構建了大腸桿菌Escherichiacoli[42-43]、谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamicum[44]、鏈霉菌[45-46]、釀酒酵母Saccharomycescerevisiae[47]等多個微生物高效底盤細胞工廠,為天然產物的高效生物合成提供平臺。萜類化合物青蒿素(artemisinin)是一種治療瘧疾的優良植物源天然產物,2015年我國科學家屠呦呦因為在青蒿素的發現及抗瘧疾研究方面的巨大貢獻獲得了諾貝爾生理學或醫學獎。為了降低青蒿素的生產成本,Keasling團隊克隆了青蒿素生物合成途徑關鍵酶的編碼基因,在酵母中構建了青蒿素合成前體青蒿酸(artemisinic acid)的異源生物合成途徑,并通過優化酵母細胞工廠,將青蒿酸的產量提高了若干數量級,具備了工業化生產的潛力[48-49],相關研究是利用合成生物學技術實現植物源天然產物高效微生物合成的重要里程碑。除此之外,Keasling團隊以半乳糖為原料,在釀酒酵母中完成了大麻素生物合成途徑的異源重構,實現了包括大麻萜酚酸(cannabigerolic acid)、四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)、大麻二酚(cannabinoid)在內的多種主要大麻素及其衍生物的生物全合成,開啟了發酵合成大麻素的新征程[50]。另外,基于合成生物學使能技術,一線廣譜抗癌藥物紫杉醇及其重要中間體也分別在大腸桿菌[51-53]、釀酒酵母[54-55]中實現了生物合成途徑的重構。伴隨著高通量測序技術的發展,合成生物學使能技術也極大地推動了微生物天然產物資源的挖掘[56],以及天然產物高效生物合成途徑的重構與優化[57-59]。

3 合成生物學助力鏈霉菌活性資源的發掘

鏈霉菌是活性天然產物的巨大資源寶庫。在放線菌產生的超過13 700余種次級代謝產物中,超過80%的天然產物來源于鏈霉菌。目前臨床和農業上使用的150多種抗生素,約2/3來源于鏈霉菌天然產物或其衍生物[60]。此外,現代組學技術也揭示了鏈霉菌基因組存在大量沉默的生物合成基因簇(biosynthesis gene clusters,BGCs),表明其具有巨大的天然產物合成潛力。利用合成生物學使能技術,發現誘導沉默基因簇表達的小分子和其他刺激因素,助力新活性化合物的表達,將加速對鏈霉菌天然產物寶庫的探索與應用[61]。

3.1 合成生物學助力天然產物生物合成基因簇的發掘

從可培養微生物中發掘新的活性分子是發現新型臨床藥物和綠色農藥的主要方法[62],挖掘可產生活性物質的菌株資源是關鍵性的一步。鏈霉菌能與多種動物、植物、真菌、細菌建立共生體系,它們作為宿主微生態系統中的天然組成成員,主要通過與宿主交換化學信號而建立穩定的相互作用。環境中的病原微生物形成的選擇壓力能使共生鏈霉菌產生有效的抗菌、抗病等化合物。根據“內共生理論”,共生菌可能產生與其宿主相同或相似的代謝產物[63-65]。因此,從藥用植物、土壤等環境中篩選鏈霉菌資源,并從中分離具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒的天然活性物質,為新藥、新活性的綠色天然農藥的研發提供了重要的途徑。但隨著鏈霉菌資源的不斷挖掘,從環境中分離新種屬的鏈霉菌以及新骨架的天然產物越來越困難[66-68]。高通量測序技術的出現和快速發展,將天然產物研究者的注意力從菌種篩選轉向了天然產物合成途徑基因的挖掘。海量基因組測序數據表明,除目前已經發現的次級代謝產物,仍存在大量活性代謝物有待開發,它們可能隱藏在未被充分探索的生態環境、未被培養的鏈霉菌以及未被激活的生物合成途徑中[56, 69]。通過建立基因組學驅動的大數據挖掘策略,能夠將這些生物合成途徑與化學實體聯系起來,推動新天然產物的發現。

宏基因組、泛基因組和基因組挖掘是目前常用的3種不同規模下的挖掘策略[70]。宏基因組挖掘策略主要基于共生關系,建立環境DNA宏基因組文庫,篩選和識別次級代謝產物生物合成途徑,為未培養微生物代謝產物挖掘提供了前所未有的機會,目前已有多個研究證明了利用宏基因組從土壤等環境中挖掘次級代謝產物的可行性[71-72]。而泛基因組和基因組挖掘則是分別針對某一菌種的多個菌株合集和某一特定的放線菌菌株進行分析。基于基因組學驅動的挖掘策略通常以序列相似性、功能特性為導向[73-74]。序列相似性導向是以次級代謝產物合成過程中保守相似的序列作為標簽,利用基因與化合物結構對應的關系指導新化合物的挖掘,如通過篩選具有保守序列標簽的多種土壤樣品,鑒定出7種有效的環氧酮蛋白酶體抑制劑和兩種稀有色氨酸二聚體天然產物[75-76];以非核糖體肽合成過程中普遍存在的自由基S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)酶、烯二炔類化合物的核心結構基因PKSE為探針進行篩選,豐富了烯二炔、非核糖體肽的種類[77-78]。功能特性導向則是利用抗性基因、顏色表型篩選等進行檢測。利用抗性基因在灰色產色鏈霉菌Streptomycesgriseochromogenes中獲得了滅瘟素的BGC[79]。面對海量的基因組數據,人們近年來陸續開發了一系列生物信息學工具用于分析鏈霉菌的基因組數據,預測天然產物的BGCs。例如antiSMASH作為一個BGC分析平臺,已被廣泛用于預測幾乎所有類型代謝產物的BGCs;TaxiBGC則提供了一個計算機平臺,用于從鳥槍法宏基因組測序數據中預測試驗表征的BGCs及其已知的次級代謝產物[80]。此外,CORASON[81]、EvoMining[82]、Antibiotic Resistant Target Seeker[83]等基于進化關系的生物信息學平臺也逐漸被開發,用于天然產物BGCs的挖掘。

3.2 合成生物學助力天然次級代謝產物資源的發掘

BGCs的深度挖掘為發現新化合物骨架、新活性天然產物提供了重要的途徑[66],然而,鏈霉菌有大量BGCs在試驗條件下仍處于沉默狀態。利用合成生物學將BGCs進行原位激活或異源表達,實現天然產物由“預測”到“產物獲得”的轉變是重要的研究內容。

通過調控BGCs內部的關鍵酶或者特異性轉錄調控因子的表達激活沉默基因簇是一種有效方式[84]。例如,聚酮合酶和非核糖體肽中的酰基或肽基載體蛋白(carrier protein,CP)需要從無活性的脫輔基apo形式活化為全酶holo形式才能發揮作用,該過程需要在磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase)的催化下完成[85]。利用這一原理,Zhang等通過過表達PPTase激活元件建立了翻譯后修飾激活的方法,在多株鏈霉菌中成功實現了沉默基因簇的激活[86]。此外,Wang等開發了一種轉錄因子誘餌(transcription factor decoy,TFD)技術,通過設計一段含有轉錄因子結合位點的核酸序列作為基因簇阻遏蛋白的誘餌,解除阻遏蛋白對BGCs表達的抑制,成功激活鏈霉菌中處于沉默狀態的多個BGCs,并獲得一種新化合物oxazolepoxidomycin A[87]。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因組編輯技術目前已被用于激活鏈霉菌沉默BGCs[88]。CRISPR技術可分為靶向激活和非靶向激活兩種方式。CRISPR技術的靶向激活是在生物信息學的指導下,精準地對鏈霉菌基因組進行編輯,以相對較高的效率啟動特定的沉默BGCs的次級代謝產物合成。例如,Zhang等利用CRISPR-Cas9技術將強啟動子kasOp*插入玫瑰孢鏈霉菌Streptomycesroseosporus內polycyclic tetramate macrolactam(PTM)的相似基因簇,激活基因簇的表達,獲得化合物alteramide A及其衍生物,同時利用該策略在委內瑞拉鏈霉菌Streptomycesvenezuelae中激活了新型色素生物合成基因簇的表達[89];利用CRISPR的基因轉錄激活(CRISPR/dCas-mediated transcriptional activation, CRISPRa)系統和基因轉錄干擾(CRISPR/dCas-mediated transcriptional interference, CRISPRi)系統,可調控微生物次級代謝物生物合成基因的轉錄效率,實現沉默BGCs的可控表達[90]。CRISPR技術的非靶向激活則是通過對鏈霉菌基因組的編輯隨機激活潛在的BGCs。例如,Culp等根據鏈霉素合成基因簇中高度保守的基因序列設計單引導(single guide RNA,sgRNA)靶序列,利用CRISPR-Cas9技術對11株放線菌的基因組進行了編輯,通過敲除鏈霉素的BGC,成功激活了thiolactomycin、amicetin和5-chloro-3-formylindole的表達[91]。目前,研究者已經開發了一系列有效的CRISPR工具盒,通過異源高效元件插入、阻遏蛋白敲除等策略實現沉默基因簇的激活。相較于傳統的同源重組方法,CRISPR技術不僅提高了基因操作的成功率,而且也為基因操作困難的鏈霉菌提供了有效的技術方法,加快了沉默BGCs的原位激活和表征。

異源表達BGCs也是激活沉默BGCs并獲得目標產物的一種有效手段。與原位激活不同,異源表達繞過了天然的調控網絡,有利于天然產物生物合成途徑的理性設計與表達。但是,異源表達沉默BGCs面臨兩個亟待解決的問題:構建良好的底盤宿主菌株和建立次級代謝產物BGCs的高效克隆技術。在底盤宿主菌株構建方面,利用CRISPR技術、Cre-loxP系統等可高效地對宿主菌的內源BGCs進行刪除[91],通過引入多拷貝位點ΦC31-attB增加基因簇拷貝數[92],以及通過更改調控元件、引入外排蛋白等方式優化底盤宿主菌[93]。目前利用上述手段已經構建了白色鏈霉菌Streptomycesalbus、天藍色鏈霉菌Streptomycescoelicolor等多個優良的底盤宿主。在大片段基因簇克隆方面,目前已經建立了多種在體內和體外克隆和組裝含有BGC的大片段DNA方法,如Red/ET、TAR、CATCH等[84, 88]。2022年,Liang等利用CRISPR-Cas12a的精準靶向切割特性和瓊脂糖凝膠包埋制備高質量基因組DNA的技術,成功開發了一種高效克隆/編輯大片段DNA的方法,簡稱為CAT-FISHING,該方法可獲得長度高達145 kb的DNA大片段,為天然產物的發掘提供了有力的技術支撐[94]。

3.3 合成生物學助力新活性分子的獲得

鏈霉菌豐富的BGCs資源及DNA高效克隆技術為活性天然產物發現提供了可能,而利用合成生物學設計、構建自然界中沒有的生物合成途徑,也逐漸成為獲得新骨架、新活性天然產物的重要方式[95-97]。

組合生物合成(combinatorial biosynthesis)通過搭建新的生物合成途徑,能夠擴展天然產物結構多樣性,是獲得新結構天然產物衍生物的研究熱點[98]。對次級代謝產物合成機制的研究發現,聚酮和非核糖體肽類化合物的結構具有極大的可塑性,目前對這兩類化合物的生物改造主要可以分為3種,一是以前體為導向,通過引入不同的起始/延伸單元進行改造;二是酶學水平的修飾;三是生物合成水平的重組[99]。以前體為導向的組合生物合成主要通過調控非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)的腺苷酰化結構域(adenylation domain,A)及聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)中的酰基轉移酶(acyltransferase,AT)結構域引入非天然前體或延伸單元,從而生成多種天然產物衍生物。例如,Kalkreuter等對苦霉素(pikromycin)延伸模塊的AT結構域進行特異性突變后,成功產生了萘內酯類似物[100];Ad等通過突變使AT結構域失活,引入獨立的反式AT結構域有效摻入氟化延伸單元從而獲得多氟化聚酮產物[101]。在酶學水平上對PKS和NRPS進行改造,如結構域的替換、模塊的替換以及模塊的合并或刪除,也是獲得新的天然產物的有效途徑[97]。例如研究者針對6-脫氧-紅霉內酯B合酶(6-deoxy-erythronolide B synthase,DEBS)進行了多種策略改造,如酮基還原酶結構域的缺失,烯脂酰還原酶的堿基替換,改變硫脂酶的位置等,獲得了一系列的紅霉素衍生物[102];也有研究對綠色生物農藥多殺菌素聚酮合酶基因進行異源結構域插入,獲得了殺蟲活性更好的丁烯基多殺菌素[103]。生物合成水平的重組是基于生物合成基因簇模塊間的序列高度重復,通過選取部分合成模塊進行重組,搭建新的生物合成通路。如基于尼可霉素(nikkomycin)和多氧霉素(polyoxin)在結構上的相似性以及在基因簇上的同源性,將兩個基因簇融合得到polyoxin N等雜合抗生素[104]。綜上,利用組合生物合成,可以從多個方面對天然產物合成途徑進行合理性改造,助力新藥的開發和新活性分子的獲得。

鏈霉菌是天然產物資源挖掘的重要源泉,合成生物學的應用推動了活性菌株資源與新天然產物的發掘。同時,合成生物學使能技術也將進一步推動鏈霉菌天然產物高效細胞工廠的構建與高效生物制造。

4 鏈霉菌天然產物高效細胞工廠構建

天然產物作為鏈霉菌的次級代謝產物,通常為生長非必要的代謝產物。菌株對這些次級代謝產物的生物合成能力與效率通常難以滿足工業生產與應用的需求[41]。了解并解析鏈霉菌的復雜代謝調控網絡,開發高效的菌株改造元件與途徑重構策略是構建高效細胞工廠,實現鏈霉菌天然產物農藥高效生物合成的重要研究內容。合成生物學“5M”策略涵蓋了元件與靶點的挖掘(mine)、模型建立與途徑設計(model)、元件組裝與通路搭建(manipulate)、菌株系統測試(measure)以及工業智能制造(manufacture)5個方面,為鏈霉菌高效細胞工廠的構建與生產提供了一種有效的研究范式[33, 105]。

4.1 Mine:元件與靶點挖掘

4.1.1挖掘合成生物學元件

合成生物學元件,如啟動子、調控因子、轉運蛋白等生物元件是構建高效細胞工廠的基礎[106]。美國麻省理工大學建立了標準生物元件登記庫,收集注冊了各種標準化生物元件(registry of standard biological parts,http:∥parts.igem.org/Main_Page)。開發多樣化的合成生物學元件將為高效細胞工廠的構建提供豐富的元件支撐。Wang等以天藍色鏈霉菌內的群體信號調控系統為研究對象,對系統內受阻遏蛋白嚴格負調控的強啟動子進行改造,獲得了一個鏈霉菌組成型啟動子kasOp*[107]。目前kasOp*已經成為應用最為廣泛的鏈霉菌啟動子之一。在kasOp*的基礎上,Bai等開發了一系列不同強度的啟動子[108];Li等[109]和Luo等[110]分別基于不同鏈霉菌的轉錄組數據建立了組成型啟動子元件庫。為了代謝適配的需求,多個鏈霉菌誘導表達系統也被開發并應用,如對異丙基苯甲酸誘導表達系統[111]、土霉素(oxytetracycline)誘導表達系統[112]、木糖誘導表達系統[113]、纖維二糖誘導表達系統[114]等。此外,不依賴于誘導劑的時序啟動子和響應特定中間代謝物的特征型啟動子也進一步被挖掘[115-116],拓展了合成生物學啟動子元件庫。除誘導系統和時序性元件外,基于別構轉錄調控因子構建的動態傳感器(biosensors)能響應胞內代謝物變化,自適應調控目標基因的激活或抑制[117],如群體感應系統[118]和響應前體乙酰輔酶A、丙二酸單酰輔酶A[119]的轉錄調控因子等,是高通量篩選、動態切換胞內代謝流的新型合成生物學元件。伴隨著合成生物學元件庫的擴增,各元件之間的干涉效應以及性能的表征尤為重要。絕緣子RiboJ被開發用于不同回路間干涉效應的消除[120]、特性表征[121]以及模塊化性能提升[108]。除上述元件外,碳源利用和產物外排轉運系統的挖掘和應用也是構建天然產物高效細胞工廠的重要手段[122]。在阿維鏈霉菌Streptomycesavermitilis中過表達麥芽糖轉運通路的malEFG-a提高了菌株對淀粉的利用效率,在縮短發酵周期的同時將阿維菌素產量提升了2.6倍[123];過表達阿維菌素的ABC轉運蛋白AvtAB,使阿維菌素活性組分B1a胞內與胞外產量的比率從6∶1下降到4.5∶1,總產量提升50%[124]。Chu等[125]開發了即插即用(tunable plug-and-play exporter,TuPPE)的聚酮類天然產物外排轉運系統,通過增強產物外排顯著提升聚酮類農藥的生物合成效率。合成生物學元件的開發和改造為構建鏈霉菌高效細胞工廠提供了重要的工具支撐。

4.1.2挖掘有效操縱靶點

理想的細胞工廠能夠最大化將碳源用于目標產物的生物合成,然而該代謝過程受到調控網絡的嚴格控制。鏈霉菌具有十分復雜的代謝調控網絡,簡單地調控目標產物的生物合成途徑難以滿足產業化的需求。因此,深度解析鏈霉菌代謝調控機制、挖掘影響鏈霉菌活性代謝產物產量的有效靶點是構建高效細胞工廠的重要研究內容。解析鏈霉菌轉錄調控因子的關鍵調控機制,如常見的SARP家族(Streptomycesantibiotic regulatory proteins)、TetR家族、LAL家族(large ATP-binding regulators of the LuxR family)等,將為重定向碳流分布,提高目標產物的產量提供重要指導。例如,過表達fredericamycin(FDM)生物合成途徑內的激活轉錄調控因子fdmR1使灰色鏈霉菌StreptomycesgriseusATCC 49344生產的FDM A產量提升6倍[126];通過解析鏈霉菌內源的群體感應系統,Tian等[127]結合CRISPRi技術對Streptomycesrapamycinicus的三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)、脂肪酸合成和氨基酸合成途徑進行動態調整,最終使rapamycin產量提升約660%。此外,Wang等基于途徑特異性的代謝物響應轉錄調控因子,開發了紅霉素響應的MphR生物傳感器,并通過核糖體結合位點(ribosome-binding site,RBS)微調mphR表達水平優化傳感器的靈敏度,結合微流體熒光激活液滴分選(fluorescence-activated droplet sorting,FADS)對生產紅霉素的紅色糖多孢菌Saccharopolysporaerythraea文庫進行了精確的高通量篩選,從野生型菌株和高產工業菌株中分別獲得了產量提高6.8倍和超過100%的突變體[128],這對高產工程菌株的進一步改造和篩選都具有重要意義。

鏈霉菌的代謝和調控機制在自然進化過程中演變得十分復雜,使得大部分關鍵基因仍未被發現。比較基因組學技術能夠在全基因組水平上挖掘影響天然產物生物合成和代謝的關鍵基因。Zhang等通過對比鹽霉素(salinomycin)高產菌株與野生型菌株的基因組差異,發現了白色鏈霉菌中鹽霉素合成的競爭基因簇和負調控基因[129];Liu等[130]通過比較分析米爾貝霉素(milbemycins)高產菌株冰城鏈霉菌StreptomycesbingchenggensisBC04和野生型菌株BC-101-4的基因組,篩選出133個與產量相關的候選基因,進一步對3個初級代謝相關的靶點基因進行組合表達,將米爾貝霉素A3/A4產量提升了26.7%。此外,利用合成生物學使能技術進行的非理性改造建立了“基因型→表型”的反向遺傳篩選,不僅能夠在基因組規模挖掘影響菌株產量的操縱靶點,同時可以進一步深化對菌株的代謝認知。RNA干擾(RNAi)和轉座子測序(transposon sequencing,Tn-seq)技術結合二代測序技術將基因型與表型相關聯,能夠篩選與目標化合物產量相關的基因。近些年CRISPR/Cas技術的快速發展和創新,不僅革新了基因編輯的方式,也拓展了其在大規模、可示蹤的反向遺傳篩選的應用,通過設計sgRNA構建全基因組擾動文庫,將CRISPRi篩選與菌株目標產物產量相關聯,獲取提升產量的潛在有益靶點。Liu等在谷氨酸棒桿菌中構建了靶向397個外排蛋白的sgRNA陣列文庫,篩選到了目前唯一已知的L-脯氨酸外排蛋白,通過過表達該外排蛋白使胞外脯氨酸產量提升了約100%[131]。這些有效操縱靶點的挖掘策略為構建鏈霉菌高效細胞工廠提供重要的技術支撐。

4.2 Model:模型建立與途徑設計

從細胞全局角度認知并理解鏈霉菌生理代謝特性對拓展代謝改造的靶向性十分必要[132]。基因組尺度生物模型(genome-scale biological models,GSBMs)通過模擬細胞的生理活動以及與環境的相互作用,能夠更深入地理解微生物的生理特性,進而反映微生物系統的復雜性和全面性。生物模型主要包括代謝網絡模型、轉錄調控網絡模型等。截至2019年,在鏈霉菌中共搭建和改造了9個GSBMs,涵蓋StreptomycescoelicolorA3(2)、S.clavuligerusATCC 27064等共8株鏈霉菌[133]。基因組尺度代謝網絡模型(genome-scale metabolic models,GSMMs)是基于基因組學數據并結合試驗數據獲得的細胞生理代謝反應的全局代謝網絡,用于表征基因-蛋白-反應(gene-protein-reaction,GPR)間的關系。利用GSMM預測,結合多種遺傳改造的方法對菌株進行定向改造,并結合穩定性同位素標記試驗驗證代謝流,為系統代謝工程研究及高效細胞工廠構建提供指導。Huang等搭建了FK506生產菌株Streptomycestsukubaensis的GSMM,通過模擬預測提升生物合成中前體和輔因子NADPH供應的潛在靶點,結合基因編輯技術進行靶點組合試驗驗證,獲得產量提升1.47倍的高產菌株[134]。Razmilic等在StreptomycesleeuwenhoekiiC34的GSMMiVR1007中也預測到增強前體供應的相關靶點,經基因編輯后有效提升了chaxalactin、chaxamycin的產量[135]。此外,Sulheim等[136]利用Sco-GSMM對異源表達“超級宿主”——天藍色鏈霉菌M1152及其母本菌株M145的蛋白質組學、轉錄組學及培養數據進行了代謝差異性分析,其結果有助于M1152作為異源宿主的代謝改造。基因組尺度的轉錄調控網絡(transcriptional regulatory network,TRNs)和GSMMs在同一時期興起,但TRNs的發展速度相對較慢。TRNs描述的是微生物細胞內轉錄因子及σ因子對基因表達的調控。其中,RNA聚合酶核心酶作為一個多通路樞紐,通過與不同的σ因子相互作用,控制胞內資源分配,以協調微生物的生長和生產[137]。為了實現微生物細胞工廠的高效性,自上而下的基因調控網絡工程從最上層的核心RNA聚合酶到主調控層,再到較低的調控層,確保胞內資源的整體轉換和精確調整。基因組尺度生物模型為構建鏈霉菌高效細胞工廠提供了重要理論指導。

4.3 Manipulate:元件組裝與通路搭建

基于對生物合成基因簇的深度解析,結合基因組規模網絡模型預測的靶點及合成生物學元件的適配,對菌株進行更深層次的遺傳操縱和改造。針對底物、代謝流、產物3個方面進行改造和重設計,同時以開發的誘導系統、生物傳感器、時序性表達等合成生物學元件進行適配表達是構建高效細胞工廠的常用且高效的策略。此外,CRISPR技術因其高效、特異性強等優勢,已經成為基因編輯操作中極其重要的技術手段。首先對于底物利用,碳源的選擇和優化以及吸收轉運是關鍵。Jin等[138]鑒定了鏈霉菌的糖吸收系統,同時利用時序性啟動子微調其表達水平,有效提高了聚酮類天然產物農藥米爾貝霉素A3/A4、阿維菌素的活性組分B1a和尼莫克丁(nemadectin)的發酵產量。對代謝流的重設計包括但不限于前體供應、輔因子及能量供給等方面[139]。Yu等[140]通過組合過表達巴豆酰輔酶A羧化酶和乙酰輔酶A羧化酶,在吸水鏈霉菌中搭建FK520合成的前體丙二酸單酰輔酶A和乙基丙二酸單酰輔酶A供應模塊,使FK520的搖瓶產量提升至3 511.4 mg/L。此外,Yu等[141]在搭建前體、還原力和能量供應模塊的同時,倍增了脂肪酸合成途徑,使脂肪酸的得率達到最大理論產量的40%。鏈霉菌作為抗生素的主要生產菌,已經進化出了抵抗機制來防止自身毒性,例如產物外排蛋白、相關的調控系統等,通過轉運蛋白工程或調控因子改造增加產物外排來提升菌株自身的耐藥性,這也是提高產量的重要策略之一[142-143]。Wei等[144]闡述了Streptomycesgraminearus中TetR家族轉錄因子GouR激活谷氏菌素外排泵蛋白GouM的表達,從而提升菌株谷氏菌素的產量。

盡管高效的合成生物學元件以及功能單元模塊的搭建能夠有效提升天然產物的合成效率,但仍有部分化合物的原生菌遺傳背景以及復雜的代謝網絡仍不清晰,導致了產物的合成能力受限,針對這類天然產物的生物合成,異源表達技術為其高效合成提供了可能。選擇遺傳背景研究較為清晰的菌株作為出發菌株,并通過基因組的最小化[44]、調控網絡的簡化進一步優化底盤細胞。其中白色鏈霉菌,因其能夠利用高效碳源——油脂的優勢,常被作為抗生素高效合成的底盤細胞[145]。與此同時,基因簇克隆技術(大片段組裝技術)也應運發展,如CATCH[146]、ExoCET[147]、CAT-FISHING[94]、CAPTURE[148]等。上述元件組裝、通路搭建和高效底盤構建技術為鏈霉菌高效細胞工廠研發提供了重要的技術策略支撐。

4.4 Measure:菌株系統測試

深度測序、多組學分析、高通量篩選等技術的發展為我們深度認知微生物的代謝調控規律,掌握菌株培養過程的系統參數提供了重要的技術支撐,并推動了菌株代謝途徑的優化以及高效微生物細胞工廠的構建,是合成生物學在微生物天然產物創制與產業化研究中的重要環節。

4.4.1篩選目標表型菌株

獲得高產天然產物生產菌株是鏈霉菌研發的重要目標。目前,高效液相色譜分析仍是確定菌株產量,篩選高產菌株的主要方法,該方法可以實現對菌株產量的精確定量,但是在大規模篩選過程中,效率相對較低。為了提高菌株篩選效率,研究者開發了雙報告基因篩選法(reporter-guided mutant selection,RGMS),利用目標BGC關鍵基因的啟動子控制報告基因,可實現報告基因的表達水平與目標BGC的表達水平的偶聯,在固體平板上實現目標菌株的高效篩選。利用該策略,Xiang等實現了克拉維酸clavulanic acid高產棒狀鏈霉菌Streptomycesclavuligerus的高效篩選[149],Guo等高效篩選到激活杰多霉素(jadomycin)和gaudimycin沉默BGCs的委內瑞拉鏈霉菌S.venezuelae菌株[150]。鏈霉菌的菌絲體形態限制了基于流式細胞儀的高通量篩選技術在鏈霉菌中的應用。Bai等建立了委內瑞拉鏈霉菌原生質體制備技術,以綠色熒光蛋白基因為報告基因,利用流式細胞儀實現了目標菌株的高通量篩選[108]。為了解決原生質體與發酵環境不匹配和存活率低等問題,Tu等開發了基于微液滴的熒光分選技術,以變鉛青鏈霉菌S.lividans66的菌絲體為篩選單元,實現了每小時篩選10 000個突變體的鏈霉菌高通量篩選[151]。此外,別構轉錄因子(allosteric transcription factors,aTFs)因具備能夠結合胞內中間代謝物和抗生素等小分子化合物的特點,已被用于開發為穩定、靈敏的高通量體外小分子檢測技術。該技術能夠定量菌株發酵產物中目標化合物的濃度,用于高產菌的高效篩選[152]。上述這些高通量菌株篩選策略對高效獲得鏈霉菌高產細胞工廠提供了重要的技術支撐。

4.4.2揭示天然產物生物合成的代謝和調控機制

為了更好地認識菌株胞內代謝分布和代謝瓶頸,建立代謝和調控網絡模型,實現對菌株再認知、再改造、再優化的螺旋式上升,單一組學已經不能滿足我們的需求。新一代測序技術、高分辨質譜技術、多組學整合分析方法以及數據庫信息不斷完善,組學技術已經逐漸發展為以多組學為主的技術手段,包括基因組學(genomics)、轉錄組學(transcriptomics)、蛋白質組學(proteomics)、代謝組學(metabolomics)和通量組學(fluxomics)等。這些組學技術的聯合應用與數據分析為系統認知菌株代謝與調控、預測新靶標、設計重構菌株代謝與調控網絡并獲得高效細胞工廠提供了重要的支撐[153-154]。

轉錄組學已被廣泛應用于研究鏈霉菌生長過程中形態-生理分化的復雜調控網絡。例如Jeong等通過對天藍色鏈霉菌S.coelicolorA3(2)不同生長階段全基因組范圍內轉錄與翻譯關系的系統研究,發現翻譯控制同樣影響著該菌株次級代謝基因的表達,改造翻譯控制系統可以為提高次級代謝產物產量提供新策略[155]。He等通過比較轉錄組數據分析阿維菌素高產菌和低產菌之間的轉錄水平差異基因,發現了明顯下調表達的TetR家族轉錄調控因子SAV151,通過敲除該轉錄調控因子發現可以將ATCC31267菌株的阿維菌素產量提高一倍[156]。代謝組學旨在整體上定性和定量小分子代謝物,是天然產物研究中的重要組學技術[157]。Tian等通過比較代謝組學分析了SAM添加對菌株代謝的影響,發現了影響阿維菌素生物合成的前體代謝物,并開發了組合添加前體代謝物的策略,顯著提高了阿維菌素的產量[158]。利用蛋白質組學技術,通過比較蛋白質表達水平能夠挖掘與天然產物生物合成相關的蛋白,也可以通過研究生長過程中蛋白質豐度的變化,揭示菌株生長和生產中涉及的生物過程和代謝途徑的調控。Gallo等對擬無枝酸菌Amycolatopsisbalhimycina巴爾赫霉素(balhimycin)生產前和生產過程中的蛋白質進行比較分析,揭示了與生產相關的主要代謝途徑[159]。蛋白質組學分析還可以研究與許多不同代謝過程相關的翻譯后修飾。Huang等采用基于高分辨質譜的蛋白質組學方法對紅霉素產生菌紅色糖多孢菌的乙酰化蛋白質組進行了研究,發現了乙酰化蛋白參與蛋白質合成、糖酵解/糖異生、TCA循環、脂肪酸代謝、次級代謝等若干重要代謝途徑[160]。

多組學相結合的方法能夠在不同水平上認知細胞的生理狀態,從而更全面地揭示天然產物生物合成代謝和調控機制,為制定高產策略提供依據。Wang等利用代謝組學、轉錄組學、通量組學等分析技術揭示了胞內三酰甘油(triacylglycerols,TAGs)在鏈霉菌初級代謝與次級代謝的“代謝轉換”中的關鍵作用,并建立了基于該認知的動態降解TAG的聚酮類天然產物高產策略,顯著提高了多種鏈霉菌聚酮化合物的產量,將阿維菌素的180 t發酵罐產量提高到9.31 g/L[161]。表達多殺菌素時發現檢測不到目標產物,Tan等基于轉錄組學,蛋白質組學、代謝組學等數據,在不同水平上確定了阻礙多殺菌素在變鉛青鏈霉菌S.lividansTK24和白色鏈霉菌S.albusJ1074中異源表達的限速步驟,并通過進一步優化,將多殺菌素在白色鏈霉菌J1074中產量提高了1 000倍[162]。這些組學技術提升了我們對鏈霉菌的代謝和調控網絡認知,為進一步工程化改造鏈霉菌,構建高產工程菌株奠定了新的基礎。

4.5 Manufacture:工業智能制造

Manufacture是指將工業菌株從實驗室擴大到工業規模進行大規模生產。下面簡述幾種成功產業化生產的天然產物農藥。

4.5.1阿維菌素

阿維菌素是唯一一個年產值達到30億元的生物農藥,最早由美國默克公司將其開發為殺蟲劑并實現商業化。我國阿維菌素的研發始于1984年,上海市農藥研究所沈寅初院士團隊從廣東揭陽土壤中分離到阿維菌素生產菌株7051菌株,該菌株于1992年轉讓給海門制藥廠(浙江海正藥業股份有限公司前身)進行工業化生產,相關成果先后獲得上海市一等獎(1995年)、化工部一等獎(1997年)和國家科技進步獎二等獎(1999年)。李季倫院士團隊于1986年開始研究阿維菌素,將其搖瓶發酵單位從最初的50～100 mg/L提高到3 500～4 000 mg/L,并在1996年與齊魯制藥廠合作完成了阿維菌素中試生產,在30 t發酵罐上的發酵單位達到3 000 mg/L,在1998年,齊魯制藥廠正式投入阿維菌素工業化生產。李季倫院士團隊的阿維菌素相關研究成果獲得了2006年國家科技進步獎二等獎。2013年1月,張立新教授主持的973項目“合成微生物體系的適配性研究”正式啟動,旨在運用新興的合成生物學手段大幅度提高阿維菌素的發酵單位。通過與企業合作,在120～550 t發酵罐中,將阿維菌素B1a的產量提高至9 000 mg/L以上,并通過優化分離提取工藝,將阿維菌素的市場價格降低至500元/kg。2015年9月,中國成為阿維菌素原藥全球唯一生產國。張立新教授團隊相關研究成果榮獲了2016年度國家科技進步獎二等獎。

目前,在國內進行阿維菌素及衍生物農藥登記的企業有10余家[163],其中阿維菌素原藥主要來自于齊魯制藥(內蒙古)有限公司、寧夏泰益欣生物科技有限公司、河北威遠生物化工有限公司、河北興柏藥業集團公司和海正藥業集團5家企業。

4.5.2井岡霉素

井岡霉素是由吸水鏈霉菌井岡變種S.hygroscopicusvar.jinggangensis產生的氨基糖苷類化合物,能夠有效防治水稻紋枯病,在亞洲各產區廣泛使用[153]。井岡霉素的有效成分為井岡霉素A,具有持效長、耐雨水沖刷、環境安全、成本低廉等優點,是一種理想的生物農藥[20]。井岡霉素最初由浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司生產,目前我國共有5家企業將井岡霉素A作為殺菌劑進行了農藥登記。

5 展望

2022年聯合國糧農組織公開信息表示,解決糧食安全的重要途徑之一是減少病蟲害帶來的損失,其中農藥的使用必不可少。在未來,我國將繼續堅持走農業可持續發展道路,堅持建立病蟲草害綠色防控體系,因此,創制高效、低毒、生態友好的綠色新農藥,并不斷降低綠色農藥的使用成本,是未來農藥研發與推廣應用的重要研究方向。其中,以活性代謝產物為有效成分的微生物天然產物農藥新品種的創制,是未來綠色新農藥研發的重要目標。

20世紀中期是微生物天然產物挖掘的黃金時代,產生了大量以鏈霉素、阿維菌素為代表的鏈霉菌天然產物藥物。但受傳統菌株篩選及天然產物挖掘技術手段的限制,新骨架和新活性化合物的開發與發現步伐減緩;同時耐藥性問題日益凸顯,特別是農業領域中作物重大病蟲草害耐藥性問題突出、新發突發重大病蟲草害缺少可有效使用的天然產物農藥。這些問題都對微生物天然產物新農藥的研發提出了新要求。合成生物學作為一門交叉學科,其“會聚”特性給微生物天然產物新農藥創制帶來了機遇,它的興起與快速發展重新打開了微生物天然產物農藥挖掘與改造的大門。隨著測序技術的不斷發展,積累了海量鏈霉菌基因組數據,結合生物信息學與機器學習手段,已經逐漸成為發現新骨架、新活性天然產物的重要研究策略,也是天然產物新農藥創制的重要研究內容。與此同時,“5M”策略在微生物天然產物新農藥的發現與推廣應用之間架起了重要的橋梁,極大地推動微生物天然產物農藥高效細胞工廠的構建與綠色生物制造。將合成生物學“格物致知,造物致用”的研究理念融入新農藥創制的研究方向,將突破現有微生物天然產物農藥創制的瓶頸,為我國農作物病蟲草害綠色防控體系提供充足的綠色農藥儲備,在進一步保障國家糧食安全、筑牢國家生物安全屏障的過程中發揮重要作用。