李東光,于 波,李笑瑩,曹 靜,王 禹

(佳木斯市中醫醫院,黑龍江 佳木斯 154002)

骨肉瘤是最常見的原發性惡性骨腫瘤,多發于青少年,發病率高峰對應于骨骼快速生長期[1]。隨著外科手術和各種化療方案的發展和進步,骨肉瘤的五年總生存率有了顯著提高,但依然存在預后較差的問題[2],因此迫切需要探究骨肉瘤發展的潛在機制,以開發更有效的骨肉瘤治療方法。從病理學角度分析,大多數腫瘤患者的免疫系統低下,免疫細胞活性被抑制,促進了腫瘤細胞生長,因此研究改善其免疫系統的藥物有利于抑制腫瘤生長[3]。骨肉瘤在中醫學中可歸屬“癌病”范疇,現代醫家認為其病因病機多與“虛、寒、痰、瘀、毒”有關,此外,邪毒與骨肉瘤的發病也密切相關,中醫藥治療骨肉瘤能夠起到增效減毒,培補正氣之功效。中藥以其獨特的治療優勢,通過多種生物活性成分、多通路、多靶點的途徑,可提高腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性[4-5]。中藥有效成分通過相關信號通路干預骨肉瘤轉移已成為研究熱點,通過抑制骨肉瘤轉移相關的STAT3、PI3K/Akt、NF-κB、MAPKs、Wnt/β-Catenin多種信號通路活性,在抑制骨肉瘤細胞轉移中發揮了重要的作用。刺五加是一種應用廣泛的中藥材,明代李時珍《本草綱目》記載其辛、微苦,溫,歸脾、腎、心經;《中國藥典》記載其具有健脾益氣、補腎安神的功效。近年來的研究證明,刺五加的活性成分對多種癌細胞類型表現出細胞毒性作用。刺五加多糖(Acanthopanax senticosus polysaccharide,ASPS)主要由水溶性多糖與堿溶性多糖組成,對機體的免疫功能具有重要調節作用。研究指出,ASPS能夠調節小鼠耳、足趾腫脹等模型小鼠血清中IL-6和TNF-α水平,參與免疫功能調節[6]。同時研究還發現ASPS可明顯抑制人非小細胞肺癌細胞株NCI-H520的增殖和轉移能力[7],但ASPS對骨肉瘤的研究鮮有報道。本研究旨在探討ASPS對骨肉瘤小鼠的抑瘤作用及免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5周大的清潔級BALB/c小鼠(18～22 g),購自河南斯克貝斯生物科技股份有限公司,許可證號:SCXK(豫)2020-0005,動物適應性喂養1周,期間隨意提供標準的食物和水,飼養環境為溫度23～25 ℃,濕度為50%～60%,12 h明/暗交替,該研究已獲得動物護理和使用委員會的批準。

1.2 實驗細胞 美國ATCC公司提供人成骨肉瘤MG63細胞株,將細胞與含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5%二氧化碳恒溫箱中孵育,2 d更換1次培養基,待細胞融合至90%后,經消化、離心后用于構建骨肉瘤小鼠模型。

1.3 實驗試劑和儀器 西安小草植物科技有限公司提供ASPS;江蘇豪森藥業股份有限公司提供順鉑;美國R&D公司提供白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒;上海碧云天公司提供RIPA裂解緩沖液;北京博奧森生物工程有限公司提供HE試劑盒;Milipore公司提供化學發光檢測試劑盒;Abcam公司提供CD4+、CD8+、程序性死亡因子1(PD-1)及配體(PD-L1)單克隆抗體。賽默飛世爾科技公司提供Attune NxT流式細胞儀;北京普天新橋技術有限公司提供PTW-1000多功能全自動酶標儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠骨肉瘤模型的構建及干預:將適應1周的小鼠,通過前肢后內側注射100 μl腫瘤細胞懸液(5×106個/ml)制備骨肉瘤小鼠模型,當小鼠長出皮下腫瘤直徑約1 cm,標記為成功造模[8],共50只小鼠建模成功,隨機分為模型組、刺五加多糖低、中、高劑量組、順鉑組,并以正常小鼠為對照組,每組10只;刺五加多糖低劑量組、刺五加多糖中劑量組、刺五加多糖高劑量組分別給予36.25、72.5、145 mg/kg ASPS灌胃干預,并給予腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液[9];順鉑組給予腹腔注射25 mg/kg順鉑,并給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃[10];模型組和對照組灌胃并腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液,每日1次,連續2周。

1.4.2 ELISA檢測血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平:末次給藥結束后,麻醉并處死小鼠,經眼球取血,離心后收集血清,按照試劑盒要求檢測血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平。

1.4.3 流式細胞儀檢測CD4+、CD8+細胞比例:經腹部主動脈取血,在37 ℃下在消化緩沖液(2.5 mg/ml膠原酶Ⅱ、2.5 mg/ml膠原酶Ⅳ和0.5 mg/ml脫氧核糖核酸酶Ⅰ)中孵育13～15 min,按照密度梯度離心法提取淋巴細胞分離液,以氬離子為光源,488 nm為激光波長,采用流式細胞儀分析CD4+、CD8+細胞比例。

1.4.4 瘤體重量及抑瘤率計算:分離各組腫瘤組織,利用電子天平稱取瘤體重量并計算抑瘤率。

1.4.5 胸腺指數和脾臟指數:摘取小鼠脾臟和胸腺,稱重后計算脾臟及胸腺指數,脾臟(胸腺)指數=脾臟(胸腺)重量(mg)/體重(g)×10。

1.4.6 HE檢測腫瘤組織病理學變化:將部分腫瘤組織經固定、石蠟包埋后制備石蠟切片,行蘇木精、伊紅染色,顯微鏡下觀察病理變化。

1.4.7 Western blot檢測腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達:RIPA裂解液提取腫瘤組織總蛋白,SDS-PAGE分離等量蛋白質并轉移到PVDF膜,將膜封閉后,與PD-1、PD-L1一抗體在4 ℃下免疫印跡過夜,在通過使用化學發光檢測試劑盒可視化之前,將膜在室溫下與二抗孵育1 h,采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結 果

2.1 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平比較 見表1。與對照組相比,模型組IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均顯著增加(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組IL-2、IFN-γ、TNF-α水平均顯著降低,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平比較

2.2 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較 見表2。與對照組相比,模型組小鼠外周血中CD8+顯著增加,CD4+及CD4+/CD8+顯著降低(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組小鼠外周血中CD8+顯著降低,CD4+及CD4+/CD8+顯著增加,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠外周血中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較

2.3 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較 見表3。與對照組相比,模型組瘤體重量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組瘤體重量顯著降低,抑瘤率顯著增加,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠瘤重及抑瘤率比較

2.4 各組小鼠胸腺和脾臟指數比較 見表4。與對照組相比,模型組脾臟指數、胸腺指數顯著降低(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組胸腺指數、脾臟指數顯著增加,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.5 各組小鼠腫瘤組織病理學變化 模型組腫瘤細胞排列緊密,細胞核較大,核膜完整;刺五加多糖低、中、高劑量組、順鉑組干預后,細胞染色逐漸變淺,部分細胞核分裂,腫瘤細胞減少,其中以刺五加多糖高劑量組、順鉑組變化較為明顯(圖1)。

2.6 各組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達比較 見表5(圖2)。與對照組相比,模型組PD-1、PD-L1蛋白表達顯著增加(P<0.05);與模型組相比,刺五加多糖低、中、高劑量組PD-1、PD-L1蛋白表達顯著降低,組間比較差異具有統計學意義(P<0.05),但順鉑組與刺五加多糖高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

··A:對照組;B:模型組;C:刺五加多糖低劑量組;D:刺五加多糖中劑量組;E:刺五加多糖高劑量組;F:順鉑組

表5 各組小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1蛋白表達比較

3 討 論

骨肉瘤是一種罕見的惡性腫瘤,主要影響兒童和青少年,化療是目前治療骨肉瘤患者的主要方式,但該疾病的惡性程度及病死率依然較高,嚴重影響患者生存期[11-12]。同時研究發現傳統化療可加重中晚期骨肉瘤患者免疫功能紊亂,不利于改善疾病癥狀,因此需要研究新的方案治療骨肉瘤[13]。中醫藥治療骨肉瘤已成為眾多學者研究的熱點,可提高骨肉瘤患者生存期,降低骨肉瘤病死率,減少化療藥物的不良反應,增效減毒,在骨肉瘤的治療中具有廣闊的應用前景。

骨肉瘤在中醫歸為“癭瘤、骨瘤、脂瘤、石瘤”等,《備急千金要方》中首次提到“骨瘤”“肉瘤”的病名,《普濟方》中提到:“氣血流行,不失其常……瘤所以生”。骨肉瘤發生的重要病因病機與氣血不和密切相關。刺五加具有補氣血、健脾養胃、活血化瘀等作用。現代藥理研究顯示,刺五加及其活性成分不僅具有免疫刺激作用,還具有抗腫瘤作用。刺五加多糖是五加科植物中的有效成分,主要由水溶性多糖和堿溶性多糖組成,具有抗腫瘤、免疫調節、降低血糖以及抗氧化等多種生物學活性,其作用機制可能與免疫功能有關,如腫瘤生長過程中,ASPS通過提高淋巴細胞增殖以及T細胞殺傷活性等抑制腫瘤生長[14]。如ASPS可以通過影響PD-L1及凋亡因子的表達抑制喉癌干細胞的增殖[15]。在腫瘤免疫反應的過程中,脾臟是免疫反應的啟動部位,而胸腺是T淋巴細胞分化的重要組織器官,兩者均在其中發揮重要作用[16]。此外,細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等以及CD4+分子和CD8+分子可通過調節免疫功能在免疫應答中起著非常關鍵的作用,CD4+/CD8+比值變化可反映機體免疫狀態[17]。本研究發現骨肉瘤小鼠中腫瘤細胞排列緊密,小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平、外周血中CD8+顯著增加,脾臟指數、胸腺指數、CD4+及CD4+/CD8+顯著降低,表明骨肉瘤小鼠免疫功能降低,促進了腫瘤生長。當ASPS干預后,降低了小鼠血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α水平、外周血中CD8+比例以及瘤體重量,提高了脾臟指數、胸腺指數、CD4+及CD4+/CD8+細胞比例,表明ASPS可抑制腫瘤生長,改善腫瘤微環境,提高小鼠免疫功能。

腫瘤免疫治療中,對腫瘤微環境中T細胞或其受體的靶向治療逐漸被研究者們所重視,并已在不同腫瘤治療中,取得了較為理想的療效[18-19]。PD-1/PD-L1是腫瘤免疫抑制的重要組成部分,被認為是免疫治療研究中的關鍵[20]。既往研究顯示,PD-1/PD-L1過表達與患者腫瘤轉移和腫瘤病死率成正相關[21],此外,PD-1、PD-L1可介導免疫逃逸[22]。當ASPS干預后,腫瘤組織中PD-1、PD-L1蛋白表達顯著降低,提示ASPS可能抑制PD-1/PD-L1實現腫瘤生長抑制以及免疫功能的改善[23-25]。

綜上所述,ASPS可抑制骨肉瘤小鼠腫瘤生長,改善小鼠免疫功能,可能與PD-1/PD-L1信號通路改變有關,為臨床骨肉瘤藥物治療提供理論支持,但其作用機制還有待完善。