四磨湯通過調控NF-κB信號通路改善重度膿毒癥大鼠結腸上皮細胞屏障功能障礙炎癥狀態作用研究

溫劍藝,王首紅,劉艷紅,張崇健,郭偉新

(廣東省人民醫院 廣東省醫學科學院,廣東 廣州 510080)

膿毒癥是重癥患者死亡的重要原因之一[1]。研究顯示[2]腸道組織是膿毒癥早期受累以及重度膿毒癥發生、發展的靶器官之一,而腸道上皮細胞屏障功能障礙是多器官以及組織衰竭的“始動”因子。Guo等[3]研究顯示在膿毒癥小鼠模型中,核轉錄因子κB(NF-κB)信號被激活,磷酸化NF-κB65 (NF-κB p65)的表達明顯升高,動物血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)等水平明顯升高,炎癥性應激加劇,患者腸道組織的免疫屏障標志物白細胞共同抗原(CD45)以及腸道上皮細胞機械屏障的標志物閉合蛋白1(Claudin-1)和閉鎖蛋白1(ZO-1)的表達明顯下降,動物結腸組織的病理損傷明顯加重。Xie等[4]研究指出,在膿毒癥患者中,炎癥性應激的晚期介質高遷移率蛋白-1(HMGB1)以及核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)伴隨NF-κB p65的表達驟增是膿毒癥趨于惡性進展的標志性事件。四磨湯出自《濟生方》,主要由木香、枳殼、烏藥、檳榔四味中藥組成,在臨床上被稱作“胃腸動力劑”[5]。本研究以盲腸結扎穿孔術(CLP)模擬膿毒癥狀態,構建大鼠重度膿毒癥模型,從NF-κB信號入手,以NF-κB信號通路激活劑佛波酯(PMA)進行功能挽救實驗,探討四磨湯對重度膿毒癥大鼠結腸黏膜的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SD大鼠,雄性,SPF級,50只,7～8周齡,體重220～250 g,購自廣東萊迪生物醫藥研究院有限公司,生產批號:SCXK(粵)2022-0064。在我院SPF級基礎動物房中,設定溫度(25±2)℃,濕度(45±5)%,12 h/12 h交替光暗周期的飼養條件下進行適應性喂養1周后用于實驗。

1.1.2 實驗試劑:NF-κB信號通路激活劑(PMA,美國Selleck公司),四磨湯口服液 (主要成分有木香、枳殼、烏藥、檳榔,湖南漢森制藥股份有限公司,規格:10 ml,國藥準字 Z20025044),多聚甲醛、二甲苯、無水乙醇等(武漢華美生物技術有限公司),兔抗大鼠NF-κB、兔抗大鼠NF-κB p65、兔抗大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、兔抗大鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、兔抗大鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司),蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(武漢凱基生物技術公司),末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)缺口末端標記(TUNEL)(北京中杉生物公司),免疫組化、免疫熒光、蛋白質免疫印跡(Western blot)試劑盒(美國Bio-Rad公司),酶聯吸附試劑盒(上海生工生物工程技術有限公司)。

1.1.3 實驗儀器:超低溫冰箱(日本三洋公司),DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳儀以及凝膠成像系統(北京六一儀器廠),REBEL 2 IN 1正置/倒置Hybrid顯微鏡(美國Discover ECHO公司),Multiskan SkyHigh Microplate Spectrophotometer 酶標儀(美國賽默飛公司),Tundra 冷凍透射電子顯微鏡(Cryo-TEM) (荷蘭賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠重度膿毒癥模型建立:根據Bi等[6]介紹的方法通過CLP術構建動物模型,腹腔注射45 mg/kg的戊巴比妥鈉將動物麻醉,無菌操作臺上,以仰臥位進行固定后,腹部備皮,沿腹正中線剪開約1 cm切口,移出腹腔中的盲腸,結扎其根部,在顯微鏡下,刺穿盲腸,擠壓盲腸,排出腸內容物后,逐層關腹。

造模術后4 h,對實驗動物從毛發豎立、腹瀉、結膜炎以及昏睡程度進行行為學評分,每項評分如下:無,記為0分;輕度,記為1分;中度,記為2分;重度,記為3分,總分為12分,評分在6～12分視為造模成功[7]。

1.2.2 大鼠分組處理[8]:按照隨機數字表法將實驗動物分為正常組、模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組。其中模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠按照上述造模術進行造模,而正常組大鼠在造模過程中僅暴露盲腸即可。

造模成功后30 min,四磨湯低劑量組大鼠每日定時以7.56 ml/kg的四磨湯進行灌胃處理,并以0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射;四磨湯高劑量組大鼠每日定時以15.12 ml/kg的四磨湯進行灌胃處理,并以0.9%氯化鈉溶液進行腹腔注射;激活劑組每日定時大鼠以15.12 ml/kg的四磨湯進行灌胃處理的同時并以5 mg/kg的PMA進行腹腔注射;而正常組和模型組大鼠每日定時以等劑量的0.9%氯化鈉溶液進行灌胃處理和腹腔注射,各組大鼠單籠飼養,自由飲水與攝食,連續給藥14 d。

1.3 實驗檢測指標

1.3.1 各組大鼠的一般狀況以及血清指標檢測:在實驗過程中,每日記錄大鼠的進食與飲水情況、精神狀態、活動量、皮毛狀態等日常行為參數。在末次給藥結束后,將大鼠禁食不禁水12 h,尾靜脈留取5 ml血液標本,離心后留取上清,按酶聯吸附試劑盒要求進行實驗操作,配置標準品溶液,終止反應,繪制標準曲線,酶標儀檢測血清中TNF-α和IL-6的含量。

1.3.2 各組大鼠結腸組織的病理學檢測:留取血液完畢,處死大鼠,顯微鏡下,逐層開腹,至暴露大鼠的結腸組織,在手術剪的幫助下,將大鼠的結腸組織取出,觀察各組大鼠結腸黏膜的狀態。將大腸結腸縱向剖開,觀察其宏觀損傷情況并進行評分:無充血、粘連,并且無水腫潰瘍點記為0分;局部出現水腫、粘連或充血記為1分,并且每增加1個充血灶點評分即增加1分[9]。之后,以4%多聚甲醛將結腸組織固定,包埋,切片,脫蠟,進行HE、PAS染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察大鼠結腸組織的病理損傷,統計每100個腸上皮細胞中杯狀細胞的數量。

1.3.3 各組大鼠結腸組織的細胞凋亡:取大鼠的結腸組織,常規固定,制成切片,按TUNEL試劑盒要求檢測各組大鼠結腸組織上皮細胞的凋亡情況,在顯微鏡下,凋亡的細胞呈現綠色熒光,正常細胞呈現藍色熒光。Image J圖像處理軟件進行統計分析[10]。

1.3.4 各組大鼠結腸組織中HMGB1和NLRP 的表達:取大鼠的結腸組織,多聚甲醛固定,BSA封閉,加入一抗(HMGB1和NLRP3的稀釋比例均為1∶100),在4 ℃下避光孵育過夜,充分清洗后,加入抗熒光二抗,防淬滅劑封片,鏡下觀察。

1.3.5 各組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達:取大鼠的結腸組織,經固定,切片,脫蠟,脫水,抗原修復,封閉后,依次加入一抗(兔抗CD45、ZO-1和Claudin-1的稀釋比例均為1∶200)、二抗(1∶1000),洗滌3次,常溫下復染、封片后,鏡下觀察,當出現棕黃色顆粒視為目標蛋白表達[11],結果判定:①按陽性細胞百分數評分,0分,陽性細胞數≤5%;1分,6%<陽性細胞數≤25%;2分,26%<陽性細胞數≤75%;3分,>76%。②按細胞著色強度評分,0分,無著色;1分,淡黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色;將兩項評分的乘積作為總評分。

1.3.6 各組大鼠結腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax的表達:取各組大鼠的結腸組織,通過RIPA裂解液提取樣本中的總蛋白,待測定其濃度后,進行加熱變性,取50 μg上樣,電泳分離,轉至PVDF膜上,封閉,加入兔抗大鼠NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax一抗(各蛋白的稀釋比例均為1∶500),過夜,洗滌3次,二抗(1∶1500)稀釋后,室溫孵育,洗滌,顯影后,以GAPDH為參照[12],Image J軟件進行統計。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示,多組間比較采用單因素分析,兩組間比較采用SNK-q檢驗;P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠的一般狀態和行為學評分比較 見表1。在實驗過程中,正常組大鼠精神狀態、運動量、皮毛、進食與飲水量、排泄以及肛周未見異常;模型組大鼠精神狀態萎靡,懶動,結膜炎嚴重,反應遲鈍,皮毛豎立且暗淡無光,進食與飲水減少,肉眼可見稀水樣便,肛周明顯不清潔;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組的行為明顯改善,尤以四磨湯高劑量組大鼠改善的程度最為明顯。實驗結束時統計分析顯示,四磨湯能明顯改善重度膿毒癥大鼠的行為,而PMA能部分逆轉這一作用,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學評分比較(分)

2.2 各組大鼠結腸組織的解剖學、病理學、超微結構損傷以及結腸黏膜杯狀細胞的變化 肉眼觀察結腸黏膜,正常組大鼠結腸黏膜光滑未見異常;模型組大鼠的結腸黏膜顏色偏暗,結腸黏膜變薄,明顯腫脹,可見明顯的充血灶點或出血條帶;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組大鼠的結腸黏膜腫脹明顯減輕,充血灶點明顯減少或出血區域明顯減小,尤以四磨湯高劑量組最為明顯。統計分析結果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結腸組織的宏觀評分明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結腸組織的宏觀評分明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組結腸組織的宏觀評分明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結腸組織的宏觀評分明顯上升,差異具有統計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠結腸組織宏觀評分比較(分)

HE染色顯示,正常組大鼠結腸黏膜各層分層清晰,未見異常,腸微絨毛正常,大腸腺結構清晰,分布豐富;模型組大鼠黏膜各層出現不同程度的水腫,炎性細胞大量浸潤,腸微絨毛或脫落或丟失,大腸腺明顯萎縮;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組以及激活劑組大鼠結腸黏膜損傷明顯改善,炎性浸潤明顯緩解,尤以四磨湯高劑量組大鼠結腸組織黏膜損傷明顯減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠結腸組織損傷病理學表現(HE染色,×400)

腸道黏膜屏障的黏蛋白經PAS染色后,呈酒杯狀的顆粒狀[13];本研究PAS結果顯示,與正常組比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結腸組織中的杯狀細胞的數量明顯降低;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組結腸組織中的杯狀細胞的數量明顯升高;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組結腸組織中的杯狀細胞的數量明顯升高;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結腸組織中的杯狀細胞的數量明顯降低,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

2.3 各組大鼠結腸組織細胞凋亡率比較 見表4。TUNEL染色結果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結腸組織中的細胞凋亡率明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結腸組織中的細胞凋亡率明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結腸組織中的細胞凋亡率明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結腸組織中的細胞凋亡率明顯上升,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠結腸組織細胞凋亡率比較(%)

2.4 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比較 見表5。酶聯免疫吸附試劑盒檢測結果顯示,在模型組中,大鼠血清中TNF-α和IL-6的含量明顯升高,四磨湯能明顯抑制大鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌,PMA能部分逆轉這一作用,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠血清中TNF-α和IL-6含量比較(ng/L)

2.5 各組大鼠結腸組織中HMGB1和NLRP3水平比較 見表6。免疫熒光檢測HMGB1和NLRP3的表達結果顯示,模型組結腸組織中HMGB1和NLRP3的表達明顯升高;四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結腸組織中HMGB1和NLRP3的表達明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組結腸組織中HMGB1和NLRP3的表達明顯升高,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表6 各組大鼠結腸組織中HMGB1和NLRP3水平比較

2.6 各組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1表達比較 見表7(圖2)。免疫組化結果顯示,與正常組大鼠比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯降低;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯升高;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯升高;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達明顯降低,差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1表達比較(免疫組化染色,×400)

表7 各組大鼠結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1免疫組化評分比較(分)

2.7 各組大鼠結腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比較 見表8。Western blot結果顯示,與正常組比較,模型組、四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結腸組織中Bcl-2的表達明顯降低,NF-κB p65、Bax的表達明顯升高;與模型組比較,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組、激活劑組大鼠結腸組織中Bcl-2的表達明顯升高,NF-κB p65、Bax的表達明顯降低;與四磨湯低劑量組比較,四磨湯高劑量組大鼠結腸組織中Bcl-2的表達明顯升高,NF-κB p65、Bax的表達明顯降低;與四磨湯高劑量組比較,激活劑組大鼠結腸組織中Bcl-2的表達明顯降低,NF-κB p65、Bax的表達明顯升高,差異具有統計學意義(均P<0.05)。

表8 各組大鼠結腸組織中NF-κB、NF-κB p65、Bcl-2和Bax水平比較

3 討 論

膿毒癥是累及肺、肝、腎、心、腦、腸等器官和組織的炎癥反應綜合征,腸道上皮損傷是重度膿毒癥的重要因素之一[14]。因此深入闡明腸道上皮屏障損傷的分子機制,在該領域中具有重大意義。

膿毒癥在中醫學中隸屬于“疽毒內陷”“外感熱病”等范疇,機體因“正虛毒損,脈絡失司”以至于熱、虛、毒、瘀橫行脈絡,主要在“益氣溫陽、清熱解毒、扶正祛邪、活血化瘀”的指導下形成了參附注射液、清熱解毒方、香砂六君子湯、四磨湯、參白解毒方等名方用于臨床上膿毒癥的治療,顯示了較為穩定的療效[15]。四磨湯為理氣扶陽的代表藥方,由木香、枳殼、烏藥、檳榔組成。現代藥理學研究顯示[16],四磨湯以及其活性組分具有良好的抗炎、抗氧化、鎮痛、免疫調節、臟器保護以及調節胃腸動力的作用。Yi等[17]研究顯示在脾虛型便秘小鼠模型中,四磨湯能調控實驗動物結腸黏膜組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達,緩解動物結腸黏膜組織的病理損傷。周慧等[18]研究顯示在心力衰竭大鼠模型中,四磨湯的應用能明顯抑制動物體內炎癥性應激的級聯放大,下調動物血清中TNF-α和IL-6的水平。本研究中以CLP構建大鼠膿毒癥模型后,四磨湯低劑量組、四磨湯高劑量組大鼠結腸黏膜組織中的細胞凋亡率明顯下降,結腸組織中CD45、ZO-1和Claudin-1的表達升高,而HMGB1和NLRP3的表達降低,結腸組織病理損傷,結腸黏膜的黏膜蛋白損傷均明顯減輕,證實四磨湯對疾病的干預作用。

腸道黏膜組織是機體抵御有害物質和病原微生物入侵的第一道防線。NF-κB信號是炎癥性應激的關鍵通路之一,在膿毒癥發生后,NF-κB被激活,NF-κB p65的表達升高,攜帶炎性信號入核,一方面能促進TNF-α和IL-6的分泌以及釋放,炎癥性應激呈現級聯放大的“瀑布樣”[19],另一方面促進晚期炎癥介質HMGB1和NLRP3的表達,推動炎癥性應激的進一步放大[20];同時誘導細胞中Bax表達的升高,下調Bcl-2的表達,誘使細胞凋亡,結腸黏膜損傷加劇[21]。本研究中以NF-κB信號激活劑PMA進行功能挽救,結果顯示PMA能部分逆轉四磨湯對結腸黏膜的修復作用,證實四磨湯通過抑制NF-κB信號而發揮作用。

綜上所述,四磨湯能明顯抑制重度膿毒癥大鼠結腸上皮細胞的炎癥應激狀態,緩解結腸組織的病理損傷,改善結腸黏膜的屏障功能,這可能與抑制NF-κB信號的磷酸化有關。但是四磨湯是否還通過調控其他信號影響疾病的進展,仍需更為深入地研究。