四磨湯對(duì)肝脾氣滯證功能性消化不良大鼠十二指腸低度炎癥及肥大細(xì)胞脫顆粒的影響

陳思清,徐 寅,藺曉源,周賽男,韓運(yùn)宗,劉 琴,陳龍彪,張海月,魏星旭

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長(zhǎng)沙 410007)

功能性消化不良(Functional dyspepsia,FD)是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)功能性疾病,排除器質(zhì)性病變后以早飽、餐后不適、燒心等為主要癥狀,約占消化道門(mén)診病例的50%,嚴(yán)重影響了現(xiàn)代人的正常生活[1-2]。FD的發(fā)病機(jī)制尚沒(méi)有統(tǒng)一的認(rèn)知,多年來(lái)主要涉及胃-十二指腸動(dòng)力減弱、腸道菌群變化及內(nèi)臟敏感性增加等方面。最新研究表明[3-4],十二指腸低度炎癥可能成為FD的又一主要致病機(jī)制。十二指腸組織局部炎性浸潤(rùn)主要表現(xiàn)為MC及嗜酸性粒細(xì)胞的局部聚集,肥大細(xì)胞(MC)脫顆粒釋放的MC標(biāo)記性蛋白類胰蛋白酶(Tryptase)、白介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等一系列活性物質(zhì)能夠直接作用于十二指腸局部,通過(guò)改變腸神經(jīng)膜電位、影響腸道平滑肌甚至與中樞神經(jīng)交聯(lián)等導(dǎo)致胃腸道運(yùn)動(dòng)減弱及感覺(jué)過(guò)敏,從而產(chǎn)生早飽、燒灼感等一系列臨床癥狀[5-7]。四磨湯起源于宋代的《重訂嚴(yán)氏濟(jì)生方》,被廣大醫(yī)家用于治療FD,效果明確且無(wú)明顯不良反應(yīng)[8-10]。目前四磨湯治療FD的具體機(jī)制仍在不斷完善與探索中,本研究從十二指腸低度炎癥出發(fā),觀察四磨湯對(duì)肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸Tryptase基因表達(dá)、血清IL-1β及TNF-α含量的影響,探究四磨湯治療肝脾氣滯證FD的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD大鼠60只,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,均為雄性大鼠,體重180～220 g。飼養(yǎng)溫度24～26 ℃,濕度50%～70%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始造模。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物:四磨湯方中人參、天臺(tái)烏藥、沉香各6 g,檳榔9 g。均購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診中藥房。生藥用10倍蒸餾水浸泡0.5 h后加蒸餾水煎煮2次,第1次1.5 h,第2次1.0 h,合并2次濾液,過(guò)濾,濃縮,4 ℃保存待用。四磨湯組給藥量分別為5.62、2.81、1.40 g/(kg·d)。灌胃容積均為1 ml/100 g 體重。莫沙必利(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,批號(hào):2E019)。給藥前用蒸餾水溶解,按人體用藥量換算成大鼠等效劑量,給藥量為0.305 mg/(kg·d),灌胃容積為1 ml/100 g體重。

1.2.2 主要試劑:大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司);大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(廈門(mén)侖昌碩生物科技有限公司);Trizol(Invitrogen,批號(hào):10296028);DEPC(MDL,批號(hào):MD911875);Ultra Pure Agarose(ABI-invitrogen,批號(hào):16500100);Super Script Ⅲ RT 逆轉(zhuǎn)錄kit(ABI-invitrogen,批號(hào):11752050);Sybr qpcr mix(ABI-invitrogen,批號(hào):4472920)。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器 熒光定量PCR儀(Applied biosystems,型號(hào):Step One Software);電泳儀(biorad,型號(hào):EPS 300)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 動(dòng)物分組與模型制備:將大鼠隨機(jī)分為六組,分別為空白組、模型組、西藥組、四磨湯高劑量組、四磨湯中劑量組、四磨湯低劑量組。選取不可預(yù)知的慢性應(yīng)激[11]對(duì)模型組及治療組小鼠進(jìn)行刺激,包括:食物剝奪(24 h);飲水剝奪合并空瓶刺激(12 h);倒懸(30 min);束縛(30 min);夾尾(1 h);明暗顛倒(24 h);濕籠飼養(yǎng)(24 h);超聲刺激(2 h);強(qiáng)迫游泳(45 ℃,5 min)。每天隨機(jī)選取上述九種刺激中的一種,刺激項(xiàng)目相鄰的兩天不重復(fù),讓動(dòng)物無(wú)法預(yù)料刺激的發(fā)生,應(yīng)激處理方法在每日上午8:30開(kāi)始更換,連續(xù)刺激21 d,每種刺激方法平均使用2～3次。第22天,所有造模大鼠繼續(xù)夾尾刺激以防止大鼠自愈,在此基礎(chǔ)上治療組分別每天灌胃相應(yīng)劑量的治療藥物及正常飲食飲水,模型組正常飲食飲水并灌胃蒸餾水。連續(xù)灌胃14 d。根據(jù)大鼠一般狀態(tài)、體重、胃排空率、小腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)率及HE染色排除器質(zhì)性病變判斷造模是否成功[12]。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 一般狀態(tài)觀察:每日觀察大鼠的皮毛色澤、精神狀態(tài)、活動(dòng)度、糞便性狀等全身情況并測(cè)量體重。

1.5.2 胃排空率及小腸推進(jìn)率的測(cè)定:提前準(zhǔn)備好半固體制劑[13],末次給藥后禁食不禁水24 h,用半固體制劑灌胃0.5 h后用3% 戊巴比妥鈉5 ml/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉,麻醉完成后剖取全胃擦干后記錄重量,然后稱取胃內(nèi)容物重量和胃凈重;剖取小腸后鋪于白紙,測(cè)量幽門(mén)至回盲腸部的長(zhǎng)度(C)和幽門(mén)至半固體制劑的長(zhǎng)度(L)胃排空率=[1-(胃總重-胃凈重)/所給半固體制劑總重]×100%;腸推進(jìn)率=L/C×100%。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材與HE染色:麻醉后剖開(kāi)大鼠胸腔,于腹主動(dòng)脈取血5 ml,將全血標(biāo)本置于室溫靜置2 h 后于4 ℃ 3000 r/min離心15 min,吸取上清,于-80 ℃條件下保存。隨后冰盒上迅速取下大鼠的十二指腸組織,PBS漂洗后一部分置于4%多聚甲醛中固定,一部分置于液氮中速凍5 min,隨后于-80 ℃冰箱中保存。將4%多聚甲醛固定的十二指腸組織用于HE染色。

1.5.4 RT-PCR檢測(cè)Tryptase mRNA表達(dá):為了檢測(cè)Tryptase mRNA在組織中的表達(dá)水平,取適量組織至1.5 ml離心管中,采用Trizol提取細(xì)胞總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成產(chǎn)物cDNA。然后對(duì)RNA進(jìn)行相對(duì)測(cè)定,循環(huán)數(shù)和溫度按試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置,引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

1.5.5 ELISA法檢測(cè)血清IL-1β及TNF-α含量:取出-80 ℃血清消融,采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-1β及TNF-α的水平,具體步驟按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài) 空白組大鼠皮毛潤(rùn)澤,精神狀態(tài)良好,飲食飲水量正常,大便成形;模型組大鼠皮毛枯黃,性情暴躁而喜聚集于籠邊,飲食飲水量減少,大便稀溏;治療組大鼠較模型組大鼠溫順,皮毛順澤,飲食飲水量增加,大便成形。

2.2 各組大鼠灌胃第14天體重比較 見(jiàn)表2。灌胃結(jié)束后,與空白組比較,模型組大鼠體重明顯減輕(P<0.01);與模型組比較,各治療組大鼠體重明顯增加(P<0.01),其中四磨湯中劑量組與西藥組體重增加明顯,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠灌胃第14天體重比較(g)

2.3 各組大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率比較 見(jiàn)表3。與空白組比較,模型組大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率均明顯降低(P<0.01);與模型組比較,除四磨湯低劑量組外,各治療組大鼠的胃排空率與小腸推進(jìn)率均顯著上升(P<0.05)。

2.4 各組大鼠HE染色結(jié)果 HE染色觀察各組大鼠十二指腸組織形態(tài)。結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞排列整齊,組織平整。與對(duì)照組比較,模型組大鼠十二指腸組織可見(jiàn)大量的腸絨毛上皮細(xì)胞脫落,固有層裸露,腸絨毛上皮細(xì)胞與固有層分離,腸絨毛形態(tài)不規(guī)則,腸絨毛上皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯的變性,固有層中腸腺數(shù)量豐富,排列整齊緊密,黏膜下層內(nèi)結(jié)締組織細(xì)密。各治療組腸絨毛上皮細(xì)胞脫落及其與固有層分離現(xiàn)象均明顯減少,腸絨毛形態(tài)規(guī)則,腸絨毛上皮細(xì)胞亦未見(jiàn)明顯的變性,固有層中腸腺數(shù)量豐富,排列整齊緊密,黏膜下層內(nèi)結(jié)締組織細(xì)密(圖1)。

圖1 各組大鼠十二指腸黏膜組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色,×100)

2.5 各組大鼠十二指腸Tryptase mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表4。RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠十二指腸Tryptase mRNA,與空白組相比,模型組大鼠十二指腸Tryptase基因的表達(dá)明顯增加(P<0.01);與模型組相比,各治療組大鼠十二指腸Tryptase基因的表達(dá)顯著下降(P<0.01);且四磨湯中劑量組較四磨湯高劑量組Tryptase基因表達(dá)下降更為顯著(P<0.01),說(shuō)明四磨湯對(duì)Tryptase mRNA水平的調(diào)節(jié)作用的量效關(guān)系以中劑量最佳。

表4 各組大鼠十二指腸Tryptase mRNA表達(dá)比較

2.6 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比較 見(jiàn)表5。ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量,與空白組相比,模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯增加(P<0.01);與模型組比較,各治療組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯下降(P<0.01)。

表5 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比較(pg/ml)

3 討 論

十二指腸低度炎癥是研究FD病理生理機(jī)制的一個(gè)新方向,而嗜酸性粒細(xì)胞以及MC等免疫細(xì)胞等的局部聚集及有關(guān)活性物質(zhì)的釋放是造成炎癥的主要原因之一[14-16]。多項(xiàng)研究表明,FD患者中確實(shí)存在MC異常激活所造成的十二指腸低度炎癥,其脫顆粒釋放的一系列活性產(chǎn)物如TNF-α、白細(xì)胞介素、組胺、5-HT、Tryptase、白三烯、前列腺素等可以造成胃腸運(yùn)動(dòng)障礙,從而產(chǎn)生FD癥狀[14-17]。西藥治療FD多采用促動(dòng)力藥、質(zhì)子泵抑制劑以及抗抑郁藥等,治療效果有限且不良反應(yīng)較多,如促動(dòng)力藥導(dǎo)致的錐體外系反應(yīng)、加重胃腸道出血等[18]。四磨湯由人參、烏藥、檳榔以及沉香四味中藥構(gòu)成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,四磨湯中的多味藥均有與抵抗炎癥相關(guān)的藥理作用,如人參中的主要成分人參皂苷與人參多糖具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[19];烏藥中的主要成分烏藥烷型倍半萜二聚體和三聚體具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等作用[20];檳榔中的檳榔堿具有消炎鎮(zhèn)痛、促胃腸運(yùn)動(dòng)、抗氧化等作用[21]。本研究表明,四磨湯能降低肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸肥大細(xì)胞脫顆粒所釋放的炎癥介質(zhì)含量以降低十二指腸低度炎癥,與相關(guān)現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果一致。MC廣泛分布于皮膚、消化道、呼吸道等部位,是人體重要的免疫細(xì)胞之一。胃腸道是人體最大的淋巴免疫器官,其免疫異常狀態(tài)可導(dǎo)致免疫應(yīng)答持續(xù)激活,產(chǎn)生持續(xù)的炎癥[22]。MC的異常激活已被證實(shí)存在于FD患者的發(fā)病過(guò)程[17]。FD的一系列癥狀產(chǎn)生于持續(xù)的免疫激活與低度炎癥,而MC脫顆粒釋放的活性物質(zhì)在此過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用[14-16]。各種刺激因素激活MC后會(huì)使其脫顆粒釋放出多種活性物質(zhì),Tryptase、IL-1β以及TNF-α均為具有致炎作用的重要活性物質(zhì)[23]。

Tryptase作為MC的標(biāo)記性蛋白,特異性地主要儲(chǔ)存在于MC胞內(nèi),是MC脫顆粒釋放出的主要活性物質(zhì),是MC激活與脫顆粒的象征[24]。常雄飛等[25]發(fā)現(xiàn),健脾理氣方能夠抑制肥大細(xì)胞脫顆粒以降低Tryptase的表達(dá)、改善十二指腸緊密連接蛋白表達(dá)以治療FD。IL-1β、TNF-α均為炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵細(xì)胞因子,在多種炎癥性疾病中發(fā)揮重要致炎作用[26-28]。本研究表明,四磨湯能顯著減少肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸MC脫顆粒,降低十二指腸組織Tryptase基因表達(dá)及血清IL-1β、TNF-α含量,以緩解十二指腸局部低度炎癥,改善FD癥狀。且四磨湯高劑量組對(duì)FD大鼠十二指腸組織Tryptase基因表達(dá)的抑制作用弱于四磨湯中劑量組,這說(shuō)明四磨湯對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的量效關(guān)系可能以中劑量最佳。

綜上所述,本研究從十二指腸低度炎癥出發(fā),探索了四磨湯治療FD的新方向,證明了四磨湯能降低肝脾氣滯證FD大鼠十二指腸低度炎癥及肥大細(xì)胞脫顆粒,以此改善模型大鼠FD癥狀。四磨湯的作用機(jī)制可能與四磨湯降低十二指腸低度炎癥以影響腸上皮、神經(jīng)、平滑肌等有關(guān),但具體信號(hào)靶點(diǎn)及作用路徑有待進(jìn)一步探究。