基于TGF-β1/Smad2/3信號通路研究芪參六味方對自發性高血壓大鼠心肌纖維化的影響

惠嫣然,董 菲,賈文浩,肖華麗,余林波,黃麗君,毛天詩,林 謙,周 鹍

(1.北京中醫藥大學,北京 100029;2.北京市宣武中醫醫院,北京 100050;3.北京中醫藥大學第三附屬醫院,北京 100029;4.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院新疆兵團阿拉爾醫院,新疆 阿拉爾 843300;5.北京中醫藥大學東直門醫院,北京 100700;6.北京中醫藥大學東方醫院,北京 100078)

2018年我國18歲以上的居民高血壓加權患病率達到27.5%,估計中國高血壓病患病人數已接近3億,且患病率總體呈增高趨勢[1]。高血壓病患者血壓長期升高常造成心肌損傷,心肌損傷后過度代償修復可導致心肌纖維化(Myocardial fibrosis,MF)。MF可進一步導致心臟舒張功能下降[2],是各種心血管疾病走向心力衰竭的主要途徑[3]。MF的病理基礎為心臟組織中心肌成纖維細胞(Cardiac fibroblasts,CFBs)的病理性增多及細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)的過度沉積[4]。基質金屬蛋白酶(MMP)與基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)是調節ECM動態平衡的關鍵酶[5]。轉化生長因子-β/Smads(TGF-β/Smads)信號通路是促進MF的重要通路[6],能夠調節MMP/TIMPs的平衡,促進ECM的產生和增殖,導致MF的發展[7]。

芪參六味方是北京中醫藥大學林謙教授立足于氣血理論而擬定的經驗方,具有益氣活血,補益肝腎的功效。課題組所在團隊前期已進行多項臨床研究[8-10],研究結果均表明芪參六味方治療高血壓舒張功能障礙療效顯著,且安全可靠。在此基礎上,本研究旨在進一步探討芪參六味方是否通過調控TGF-β1/Smad2/3通路改善MF,從而改善心臟舒張功能,為臨床提供基礎研究依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 20周齡雄性自發性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats,SHR),同齡雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-kyoto rats,WKY),SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK(京)2012-0001。飼養于北京中醫藥大學東直門醫院醫學實驗中心SPF級動物房,恒溫恒濕,專人喂養。

1.2 藥物與試劑 芪參六味方配方顆粒,其原方組成為:生黃芪、丹參、川芎、葛根各30 g,熟地黃、澤瀉、益母草各15 g,三七、山茱萸、茯苓、夏枯草各10 g。按比例提取為配方顆粒,應用時使用無菌蒸餾水配制灌胃液進行灌胃。氯沙坦鉀片(國藥準字J20180054),使用時無菌蒸餾水溶解。

30%丙烯酰胺(北京索萊寶生物科技有限公司)、1 mol/L Tris-HCL(pH6.8)(北京索萊寶生物科技有限公司)、1.5 mol/L Tris-HCL(pH8.8)(北京索萊寶生物科技有限公司)、4×蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶生物科技有限公司)、PCR引物(北京Invitrogen公司)、預染蛋白marker(美國thermo公司)、PVDF膜(美國MILLPORE公司)、Masson染色試劑盒、天狼猩紅染色試劑盒、增強型ECL試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)、一抗GAPDH(美國bioworld公司)、二抗(美國KPL公司)。

1.3 實驗儀器 小動物超聲心動檢測儀(美國Visual Sonics公司)、凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)、渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、離心機(德國Eppendorf公司)、熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、電泳儀、垂直電泳槽、轉移槽(北京六一儀器廠)、分光光度計(美國Therno scientific公司)。

1.4 分組與給藥 將15只20周齡雄性SHR大鼠隨機分為模型組、中藥組、氯沙坦鉀組,每組5只,5只同齡雄性WKY大鼠作為對照組;適應性喂養1周后,各組給予相應藥物灌胃,共干預12周。具體方案如下:①中藥組劑量為34.16 g/(kg·d),相當于臨床常用劑量;②氯沙坦鉀組劑量為8.33 g/(kg·d),相當于臨床劑量50 mg/d;③對照組與模型組予等量無菌蒸餾水。

1.5 觀察指標

1.5.1 超聲心動檢測:使用Vevo770型小動物超聲心動檢測儀檢測大鼠心臟功能。大鼠脫毛后,使用2%異氟烷持續吸入待角膜反射消失。在左室短軸位的乳頭肌水平,測量并計算左室射血分數(LVEF)與左室短軸縮短率(LVFS);心尖四腔心切面,測量舒張早期跨二尖瓣血流速度(E)與舒張早期二尖瓣環運動幅度(E’),計算E/E’值。每個參數均在同一部位重復測量3次,取平均值。

1.5.2 左室心肌病理染色及膠原含量測定:將大鼠斷頸處死后迅速取左室心肌組織,4%甲醛溶液中固定48 h后,石蠟包埋切片。進行Masson染色及苦味酸-天狼猩紅染色。在普通光學顯微鏡下觀察膠原纖維含量及分布,Masson染色下膠原纖維呈藍色,苦味酸-天狼猩紅染色下膠原纖維呈粉紅色;在偏光顯微鏡下觀察Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ含量及分布。利用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件測量兩種膠原纖維的面積,并計算Collagen Ⅰ/Collagen Ⅲ比值。

1.5.3 Western blot法測定各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9、TIMP-1、TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白的表達:采用Western blot法檢測。心肌組織研磨后加入RIPA細胞裂解液充分裂解,離心提取蛋白,制備SDS-PAGE凝膠,電泳;將蛋白轉印至PVDF膜上,室溫下封閉1 h,加入一抗工作液,在4 ℃條件下反應過夜;TBST洗膜后加入二抗工作液,室溫孵育1 h,再次洗膜;加入ECL發光液顯影。完成后使用UVP凝膠成像分析系統,采圖并分析灰度值。

1.5.4 RT-PCR法檢測各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達:采用實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)法檢測。按照Trizol試劑說明書提取心肌組織中的總RNA,用分光光度計檢測純度及含量;參照Real-Time PCR試劑盒說明書將提取的RNA反轉錄成cDNA,加入相應引物進行擴增,引物如下(購自北京Invitrogen公司)。GAPDH:上游5’-CTGACTTCAACAGCGACACCCA-3’,下游5’-CCACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’;TGF-β1:上游5’- TTCCTGGCGATACCTCAGCAACC-3’,下游5’- TCAATTTCCCCTCCACGGCTCA-3’;Smad2:上游5’- TCATGCCAACAGAAAACTTCGAG-3’,下游5’- TTCCTTAGACTGTGGGATGC-3’;Smad3:上游5’- AGGGCTGCTCTCCAATGTCA-3’,下游5’- CGAAGACCTCCCCTCCGAT-3’;目的基因和內參分別進行RT-PCR反應。每個樣本檢測3個復孔。數據采用2-ΔΔCt法分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS 24.0 統計學軟件進行分析。數據資料均為計量資料,以均數±標準差表示。組間差異比較用單因素方差分析;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心臟收縮與舒張功能比較 見表1。與對照組比較,模型組大鼠LVEF、LVFS均明顯降低(P<0.05),E/E’明顯升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組與氯沙坦鉀組E/E’顯著下降(P<0.01)。結果表明,芪參六味方可顯著改善SHR大鼠的左室舒張功能。

表1 各組大鼠心臟收縮與舒張功能比較

2.2 Masson染色及各組大鼠心肌膠原纖維面積比較 Masson染色結果顯示,對照組大鼠心肌肌束間有少量的藍色膠原纖維,排列均勻。與對照組比較,模型組藍色區域明顯擴大,心肌肌束間隙增寬,在心肌細胞間質中可見明顯的纖維化改變,且伴有較多膠原沉積。與模型組比較,中藥組與氯沙坦鉀組MF程度較輕,膠原含量較少,排列較均勻。見圖1。

圖1 大鼠心肌組織膠原纖維分布圖(Masson染色,×400)

心肌膠原纖維面積百分比比較顯示,與對照組(0.06±0.06)%相比,模型組膠原纖維面積百分比(4.12±3.72)%顯著升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組(0.45±0.57)%、氯沙坦鉀組(0.34±0.52)%膠原纖維面積顯著縮小(P<0.01)。

2.3 苦味酸-天狼猩紅染色及各組大鼠Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ分布比較 在普通光鏡下,苦味酸-天狼猩紅染色淡黃色區域代表心肌細胞,粉紅色區域代表膠原纖維。對照組心肌間質中膠原纖維含量較少,排列均勻;與對照組比較,模型組膠原含量明顯增多,排列紊亂;與模型組比較,中藥組及氯沙坦鉀組膠原含量均減少,排列較均勻,其中中藥組膠原纖維含量最少,排列均勻,與對照組差異較小。

在偏光顯微鏡下觀察經苦味酸-天狼猩紅染色左心室心肌組織切片,可以清晰顯示Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ,Collagen Ⅰ纖維排列緊密,呈橙黃色或亮紅色,Collagen Ⅲ分布在Collagen Ⅰ周邊,呈綠色。對照組心肌膠原分布均勻,含量較少;與之比較,模型組可見膠原纖維數量增多,排列紊亂,以Collagen Ⅰ增多為主;與模型組比較,中藥組及氯沙坦鉀組膠原纖維面積減小,以Collagen Ⅰ減少為主,排列紊亂較輕。見圖2。

圖2 普通光鏡及偏光顯微鏡下大鼠心肌組織膠原纖維分布圖(苦味酸-天狼猩紅染色,×400)

偏光顯微鏡下計算大鼠左室心肌組織Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ面積比值百分比,結果顯示,與對照組比較,模型組比值顯著增大(P<0.01);與模型組比較,中藥組、氯沙坦鉀組比值明顯減小(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠CollagenⅠ與Collagen Ⅲ面積比值比較(%)

2.4 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9及TIMP-1蛋白表達水平比較 見表3(圖3)。Western blot結果顯示,與對照組比較,模型組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達量顯著增加(P<0.01);與模型組比較,中藥組與氯沙坦鉀組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達量顯著下降(P<0.01)。與對照組比較,模型組MMP-9蛋白表達量顯著升高(P<0.01),TIMP-1蛋白表達量顯著降低(P<0.01);與模型組比較,中藥組MMP-9蛋白表達量明顯降低(P<0.05)。結果表明,芪參六味方可以調節MMP-9/TIMP-1的平衡,降低SHR大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達,減輕MF程度。

圖3 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9、TIMP-1蛋白表達

表3 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-9及TIMP-1蛋白表達水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平比較 見表4(圖4)。與對照組比較,模型組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達量均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達量均顯著降低(P<0.01),氯沙坦鉀組Smad2、Smad3蛋白表達量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。結果表明,芪參六味方可能通過調控TGF-β1/Smad2/3通路相關蛋白的表達,改善SHR大鼠MF。

表4 各組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平比較

2.6 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達水平比較 見表5。與對照組比較,模型組TGF-β1、Smad2 mRNA表達水平均顯著升高(P<0.01),Smad3 mRNA表達水平有升高趨勢;與模型組比較,中藥組TGF-β1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01),中藥組、氯沙坦鉀組Smad2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。結果表明,芪參六味方可能通過調控TGF-β/Smads通路TGF-β1、Smad2 mRNA的表達,改善SHR大鼠MF。

表5 各組大鼠心肌組織TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達水平比較

3 討 論

高血壓歸屬于“眩暈”范疇,臨床應用較為廣泛,另外“頭痛”“脈脹”“肝風”等臨床中也常有應用。《素問》言:“諸風掉眩,皆屬于肝。”肝主疏泄,若肝氣郁滯,則疏泄失職,肝郁日久化火則肝火亢盛,陰傷無以潛陽,則肝陽上亢,肝腎同源,虛損及腎,則肝腎虧虛,因此臨床多從肝腎論治高血壓。隨著病情的進展,高血壓心肌纖維化患者可能出現心悸、氣喘、胸悶、胸痛等癥狀,因此根據患者臨床特點,常將心肌纖維化歸屬于“胸痹心痛”“心悸”和“喘證”等范疇。也有學者將高血壓心肌纖維化命名為“風眩合并心脹”[11]。周明龍等[12]基于“久病入絡”理論,認為“血瘀”是高血壓心肌纖維化的基本病機,治療當以活血化瘀為主。吳美芳等[13]認為本病病性為本虛標實,陽虛為本,痰濁、瘀血為標,治療以益氣溫陽、活血祛痰為法。王奇林等[14]認為本病以心、肝、腎陰虛陽亢為主,長期心陰不足導致水濕、血瘀內停,治療當以滋陰潛陽為法,兼以祛濕化瘀。蔣嘉燁等[15]認為本病屬痰濕壅盛,治療以化痰息風、健脾祛濕為法。基于長期的臨床觀察和團隊前期的一項橫斷面調查發現,高血壓合并舒張功能障礙患者表現為“肝腎不足,氣虛血瘀”的證候特點[16]。《醫學真傳》言:“人之一身,皆氣血之所循行,氣非血不和,血非氣不運”。“氣為血之帥,血為氣之母”,心主血脈,心氣可推動血液運行,濡養周身,肝腎不足日久心氣亦虛,心氣虛則血液運行無力,而致心脈瘀阻。血瘀進一步又阻礙氣機,進而加重氣虛,最終導致心肌纖維化。由此可見,肝腎不足、氣虛血瘀是高血壓心肌纖維化的核心病機,治療當以益氣活血、補益肝腎為主。

芪參六味方立足于氣血理論而創立,具有“益氣活血、補益肝腎”的功效。前期團隊基礎研究證實,黃芪、黨參、丹參等益氣活血藥物可以改善舒張性心力衰竭大鼠的心室舒張功能[17]。采用黃芪、丹參干預受Ang Ⅱ刺激后肥大的心肌細胞,發現可顯著降低心肌細胞總蛋白含量的代償性表達,抑制心室重構[18],且能通過調節鈣穩態改善肥大心肌細胞的舒縮功能[19]。課題組所在團隊前期已進行了多項隨機對照臨床研究,其中一項隨機、對照、雙盲臨床試驗研究納入了104例高血壓舒張功能障礙患者,結果發現,芪參六味方干預8周后,治療組中醫證候積分和主要癥狀積分降低,癥狀改善明顯,左室舒張功能及左室舒張末內徑均較對照組有顯著改善[8]。

MF是高血壓出現心臟舒張功能障礙的病理基礎和必經環節。MF可使心肌的僵硬度增高,進而導致心肌順應性下降[20]。E/E’是判斷心臟舒張功能的重要指標,E/E’≥8提示存在舒張功能障礙[21]。高血壓MF最終可導致心力衰竭,且與心血管死亡風險直接相關[22],因此MF的防治至關重要。中醫藥在改善高血壓癥狀及心臟功能、抑制或逆轉MF等方面具有一定優勢。丁秀婷等[23]發現銀杏內酯B可抑制SHR大鼠心肌纖維化。朱力權[24]采用益氣活血補腎法治療高血壓左室舒張功能障礙,發現相較于傳統西藥治療,益氣活血補腎法可有效改善臨床癥狀,并有助于控制血壓和改善心臟舒張功能。宋曉龍等[25]采用補虛瀉實、活血化瘀法治療冠心病心力衰竭,發現利心水方在改善冠心病心衰患者心肌重構方面功效顯著,可一定程度上改善心肌纖維化。芪參六味方臨床已應用多年,療效顯著,但仍缺乏相應的基礎研究證據,因此本研究采用SHR大鼠模型,通過對比中藥組與模型組心臟的收縮與舒張功能、心肌組織纖維化病理改變、纖維化及TGF-β1/Smad2/3信號通路相關蛋白及mRNA表達水平,證實芪參六味方可以通過TGF-β1/Smad2/3通路改善SHR大鼠MF。

ECM主要由Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ組成,膠原纖維可維持心肌纖維排列[26],影響心室僵硬度[27]。ECM的過度沉積是MF的主要病理特征之一,主要表現為膠原空間結構排列紊亂、膠原蛋白的大量沉積及Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ比例失調等[4],從而導致心肌順應性下降,影響心臟舒張功能。本研究采用SHR大鼠MF模型,干預12周后檢測大鼠的心臟舒縮功能,結果顯示,模型組大鼠LVEF、LVFS均明顯低于對照組,E/E’明顯升高,說明模型組大鼠心臟收縮、舒張功能出現障礙;取大鼠心肌組織進行觀察,相較于對照組,模型組心肌細胞間質中纖維化改變明顯,膠原大量沉積,Collagen Ⅰ與Collagen Ⅲ比例失調,以Collagen Ⅰ增多為主。相較于模型組,中藥組E/E’明顯降低,心臟舒張功能明顯改善,鏡下可見膠原沉積減少,膠原纖維排列結構均勻,且主要以降低Collagen Ⅰ為主。氯沙坦鉀組以上結果與中藥組相似。說明芪參六味方可通過改善ECM的沉積,抑制或逆轉MF,改善SHR大鼠的舒張功能,且效果不劣于氯沙坦鉀。

MMP/TIMPs比值失衡在MF中起著至關重要的作用,常作為MF的生物標志物,MMP可誘導ECM中包括膠原纖維在內的各種蛋白質的降解,TIMPs是MMP的內源性特異性抑制酶[5]。MF發展過程中,TIMP-1持續上調,MMP-9對ECM的調節與TGF-β/Smads信號通路有關[28],且與MF呈正相關[29]。MMP/TIMPs之間的平衡對于心肌組織中ECM的重建至關重要,因此本研究對大鼠心肌組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達水平進行測定,發現模型組MMP-9蛋白表達水平顯著升高,TIMP-1蛋白表達水平顯著降低;相較于模型組,中藥組主要降低了MMP-9蛋白表達水平,一定程度上改善了MMP/TIMPs比值失衡,從而減輕ECM的異常沉積,促進ECM重建,抑制甚至逆轉MF進程。

高血壓病血壓升高導致的心肌組織壓力負荷升高及RAAS系統的激活是造成MF的主要原因之一[30]。TGF-β是一種多功能細胞因子,參與成纖維細胞增殖、轉化和遷移的調節,以及ECM的產生[31]。高血壓可通過血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)上調TGF-β1的表達和釋放[32],TGF-β1是調節MF的重要因子,其上調或激活是導致MF的多種機制的共同途徑和中間橋梁[33],且其表達水平與疾病嚴重程度可能存在一定相關性[34]。TGF-β/Smads信號通路是導致MF最經典的一條通路。通路激活時,Samd2/3被大量磷酸化,誘導TGF-β1蛋白信號轉導,介導后續信號通路的傳遞[6],影響MMP/TIMPs之間的平衡[7],進而造成ECM的異常沉積。本研究對大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白及mRNA表達水平進行測定,模型組大鼠TGF-β1與Smad2蛋白及mRNA表達水平、Smad3蛋白表達水平均明顯升高,提示TGF-β1/Smad2/3通路調控本研究MF模型的發生發展。相較于模型組,中藥組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平顯著降低,表明芪參六味方可以通過抑制TGF-β1/Smad2/3通路的過度激活,調節MMP-9/TIMP-1之間的平衡,減輕細胞外基質的沉積,抑制或逆轉MF,改善SHR大鼠左室舒張功能。

綜上所述,MF是高血壓發展到心臟舒張功能障礙的病理基礎,TGF-β1/Smad2/3通路是促進MF的一條經典通路。本研究針對高血壓MF肝腎不足,氣虛血瘀的基本病機,采用芪參六味方干預SRH大鼠MF模型,證實芪參六味方可通過抑制TGF-β1/Smad2/3通路的過度激活,調節MMP-9/TIMP-1之間的平衡,抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達,其中以抑制Collagen Ⅰ蛋白表達為主,減輕細胞外基質的沉積,抑制或逆轉SHR大鼠心肌纖維化,改善SHR大鼠左室舒張功能,且芪參六味方治療高血壓MF療效不劣于氯沙坦鉀。