耐低溫真菌對土壤中吸附態PAHs的降解特性

蘇 丹 趙 祥 董昱杉 劉鳳飛 王 鑫

（1.遼寧大學環境學院，遼寧 沈陽 110036；2.沈陽大學區域污染環境生態修復教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110044）

多環芳烴（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）化合物是一類性質穩定、在環境介質中廣泛存在，且具有“三致”效應的有機污染物[1]。隨著固定化微生物以及生物強化技術的發展，高效優勢菌種的純化分離及其降解特性，成為PAHs 微生物修復技術應用的關鍵[2]。針對北方寒冷地區多環芳烴污染的土壤修復的技術需求，該研究從雞西某煉油廠受凍融交替作用的表層PAHs 污染土壤中，篩選分離出1 株以腐殖酸（Humic Acid，HA）吸附態PAHs 為碳源的耐低溫菌株——高山被孢霉（Mortierella alpina JDR7），將其作為耐低溫真菌降解PAHs，為北方寒冷地區PAHs 污染土壤修復提供了新的生物修復材料.并研究了高山被孢霉（Mortierella alpine JDR7）對凍融土壤中芘（Pyrene，Pyr）和苯并[a]芘（Benzo（a）anthracene，BaP）的降解性能，旨為在北方寒冷地區PAHs 污染土壤微生物修復提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養基

腐殖酸（HA）由沈陽奇特爾科技有限公司提供，其交換容量（CEC）為3.74mmol/g。芘（Pyr，純度＞98%）和苯并[a]芘（BaP，純度＞98%），丙酮（分析純），乙腈（色譜純），二氯甲烷（分析純），正己烷（分析純），水為Millipore超純水。

營養培養基（CM 培養基）：蛋白胨10.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，pH 為7.0～7.2，以蒸餾水定容至1000mL，121℃滅菌25 min，固體培養基另加瓊脂粉20g/L。

無機鹽選擇培養基：K2HPO41.0g，（NH4）2SO45g，MgSO4.7H2O 0.5g，pH 為7.0～7.2，以蒸餾水定容，121℃滅菌25min，加入10g/L 的HA 溶液，加入10mg/L～30mg/L Pyr和BaP 的丙酮溶液作為碳源和能源，置于超凈工作臺紫外滅菌，待丙酮揮發后用于菌種的篩選富集。

1.2 菌株對PAHs 降解試驗

試驗設計4 個處理組：1）對照（CK）：不加HA 不接菌。2）添加HA。3）接種降解菌（JDR7）。4）添加HA并接菌（HA + JDR7）。

修復試驗用土壤采自中科院沈陽生態試驗站0～20cm表層清潔土，土壤為草甸棕壤，土壤過2mm 篩后，分裝培養瓶中，每瓶3g，121℃高溫滅菌60min，冷卻后每瓶定量加入Pyr 與BaP 的丙酮溶液，使其初始濃度均為30mg/kg，放置過夜，按10%接種菌懸液，菌體初始濃度為6×106CFU/mL。按5.0%用量投加HA，隨時補加無菌水，使土壤水分為30%。置凍融循環箱（ZT-CTH）中避光培養，凍融循環模式為-5℃凍結12h，15℃解凍12h，分別在0d，7d，14d，21d，28d，35d 和42d 取樣測定土壤中PAHs的殘留量。

用高效液相色譜HPLC（Agilent 1200 型）對PAHs 進行測定，色譜柱為C-18 柱（ZORBAX Eclipse）。提取方式如下：稱取1g 土樣裝入50mL 玻璃瓶中，加入20mL 丙酮，15mL 二氯甲烷，10mL 15%的氯化鈉溶液，超聲波萃取8h。靜置1h 后，吸取2mL 有機相，移至凈化柱（1g中性Al2O3+1g 硅膠+1g 無水氯化鈉）用25mL 正己烷，二氯甲烷（體積比為9 ∶1）淋洗，收集濾出液，濃縮至約1mL，再用柔和氮氣吹干，用2mL 乙腈定容后測定，進樣量10μL，流動相為乙腈/水= 85 /15（ v /v），流速0.5mL/min，柱溫為35℃。試驗中設空白對照和平行試驗進行質量控制。

2 結果和討論

2.1 真菌對PAHs 降解能力比較

由圖1 可知，2 種PAHs 在培養42 d 后均有不同程度降解，42d 后各處理土壤中PAHs 含量順序如下：CK ＞HA＞JDR7 ＞HA+JDR7。在低溫條件下，Mortierella alpine JDR7 對土壤中Pyr 和BaP 顯示出一定的降解能力，42d 降解率分別為68.13%和59.51%。Vacca 等[3]發現用溶液態Phe 篩選獲得降解菌不具有直接礦化土壤顆粒吸附態Phe的能力。而該研究篩選的真菌Mortierella alpine JDR7 在土壤中表現出一定對Pyr 與BaP 的降解能力，這是因為JDR7是采用HA 吸附態PAHs 篩選獲得的降解真菌，具有直接礦化吸附態PAHs的能力。

此外，由圖1 可知，HA 的加入能夠提高JDR7 對土壤中Pyr 和BaP 的降解率，42d 降解率分別為82.0%和71.8%，與JDR7 處理（未添加HA）土壤中的降解率相比分別提高13.8%和12.3%，表明HA 對PAHs的增溶作用明顯。

圖1 不同處理方式處理后土壤中PAHs的去除率

高分子量PAHs的低生物可利用性也是自然條件下污染土壤微生物修復的一個難點，這無疑會阻礙污染土壤修復的進程。PAHs 不易被微生物利用主要是因為其水溶性低，Mortierella alpine JDR7 可降解土壤中Pyr 和BaP，但受土壤中PAHs 生物利用率低的影響，降解率較低，而先用HA 增溶洗提土壤中的PAHs，HA 可在修復體系中形成膠束，降低油-水界面張力，PAHs 能夠進入膠束內部或吸附在膠束疏水基上，減少PAHs 在土壤上的吸附，促進PAHs 從土壤有機質中解吸出來，增加其流動性，提高土壤中PAHs的生物有效性[4]，從而提高PAHs的降解率。

2.2 真菌對PAHs 降解速率比較

微生物能分泌一些酶類啟動其對PAHs的降解過程，底物（Pyr 或BaP）和酶屬于典型的酶催化反應。反應符合Michaelis-Menton 動力學。圖2（a）、圖2（b）描述了經過4 種不同處理后土壤中Pyr 和BaP 隨時間的降解動力學曲線。

圖2 不同處理方式處理后土壤中PAHs 含量的動態變化

在試驗初始階段PAHs的降解轉化速率均較快，隨后則出現緩慢的反應趨勢，這是因為初期PAHs 濃度較大，反應速度較快，隨后PAHs 濃度降低使反應速度減慢。土壤中PAHs的擴散轉運速率遠遠低于其降解速率，初期降解菌營養供應不足，也有降低反應速度的可能性[5]。

HA 的加入極大地提高了Mortierella alpine JDR7 對PAHs的降解速率，第一周，Pyr 和BaP 的降解速率分別為1.34-1和1.15-1，可分別降解31.36%的Pyr 和26.83%的BaP，添加HA 后，Pyr 和BaP 的降解速率分別提高至1.74-1和1.53-1，可降解40.67%的Pyr 和35.66%的BaP，較未添加HA 時降解能力分別提高29.69%和32.93%。隨后5 周，Pyr 和BaP 的降解速率分別為0.32-1和0.28-1，添加HA 后，降解速率分別提高至 0.35-1和0.31-1，較未添加HA 時降解能力分別提高了12.28%和10.69%.

隨著時間的推移，進入土壤的PAHs 會出現老化現象[6]。如何將土壤中吸附的PAHs 脫附出來，是提高PAHs 生物降解速率的關鍵步驟，HA 的加入極大地提高了JDR7 對PAHs的降解速率，原因如下：其一，Mortierella alpinaJDR7的篩選馴化是在吸附態PAHs 作為碳源的環境下進行的，使其從一開始就處于工作的環境，縮短了對吸附態PAHs降解的反應時間；其二，由于微生物細胞通常不能進入小于0.2um 的微孔隙，微生物對微孔隙中PAHs的利用受阻，使土壤中大部分PAHs 與降解菌分隔開[5]，HA 是高分子聚合物，具有親水性、吸附和絡合性，能有效提高PAHs的溶解性和遷移性[7]，促進PAHs 從土壤微孔隙中釋放，同時，真菌JDR7 絲狀菌絲生長繁密，縱橫交錯成網狀，隨著菌絲的生長而移動，使其更好的接觸污染物，進而提高其對Pyr 或BaP 的降解速率。

2.3 降解動力學

建立Monod 模型，推導后得到公式（1）。

式中：c為Pyr 和BaP 濃度，mg·kg-1；t為反應時間，d；K為動力學常數。Pyr 或BaP 的降解符合一級動力學特征，結果見表1。

表1 JDR7 對土壤中多環芳烴的降解動力學和參數

經JDR7 處理的土壤中Pyr 和BaP 的半衰期分別為16.6d 和29.1d，在經BaP 處理的土壤中，該株真菌僅用20d 就可以使BaP 濃度減少50%。添加HA 后，縮短了MortierellaalpineJDR7 對PAHs的降解半衰期，Pyr 和BaP的半衰期縮短至13.9d 和17.9d。

對PAHs 有較高降解能力的微生物，不一定同時也具有較高的降解速率，所以實際應用中，要全面考慮菌株的特性，根據實際修復要求選擇高效降解菌。采用HA 吸附態PAHs 篩選獲得的Mortierella alpine JDR7，在低溫條件下對HA 吸附態Phe、Pyr 和BaP 降解能力強，降解速率快，如果要在寒冷地區選擇Mortierella alpine JDR7 作為固定化菌株，可添加HA 提高其修復效果。

北方寒冷地區土壤受凍融作用影響，結凍會導致大部分微生物休眠，但冷適應微生物對結凍環境卻表現出較高抗性[8]，如將游離的耐冷菌直接應用于PAHs 污染土壤，在實際修復過程中游離菌往往會面臨土著菌的競爭、中間代謝產物的毒害、惡劣的環境條件等多重壓力，導致有效降解菌存活率低、單位體積降解菌密度低、PAHs降解速率慢。為解決上述問題，可采用固定化微生物技術，以強化耐冷菌對凍融交替條件下PAHs 污染土壤的原位修復效果。

3 結論

高山被孢霉在低溫條件下對Pyr 和BaP 均具有一定的降解能力，42d 降解率分別為68.13%和59.51%.加入HA能夠提高其對Pyr 和BaP 的降解率，42d 分別提高至82.0%和71.8%，分別提高了13.8%和12.3%。

Michaelis-Menton 動力學方程分析表明，加入HA 能夠提高高山被孢霉對Pyr 和BaP 的降解速率，第一周降解速率分別提高29.69%和32.93%。隨后5 周，降解速率分別提高12.28%和10.69%。

一級反應動力學模型分析表明，土壤中Pyr 和BaP 經高山被孢霉處理后半衰期分別為16.6 d 和29.1d，添加HA后，半衰期縮短至13.9d 和17.9d。