丹參提取物對去卵巢模型大鼠骨質疏松的影響

王玥，陳薇，楊志國，張艷艷，王浩，徐詠全，劉垚杰，李麗維，*

（1.天士力研究院，天津 300410；2.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；3.天津天士力（遼寧）制藥有限責任公司，遼寧阜新 123000）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低及骨組織微結構破壞為特征，導致骨脆性增加的代謝性骨病[1]，基本發病機制是成骨細胞與破骨細胞的功能失衡，骨吸收遠大于骨形成，導致骨量丟失。近年來隨著人均壽命的延長以及老齡人口的增加，骨質疏松的發病率也日益增高。傳統中醫理論認為骨質疏松，以腎虛為主，血瘀為害，互為因果，血瘀是骨質疏松癥的促進因素，若氣血兩虛，則影響骨的營養及骨代謝[2]，且現代研究也證實微血管改變是瘀血證的病理基礎，瘀血是引起骨質疏松性骨痛的重要機制之一。

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根和根莖，性味苦，微寒，歸心、肝經，具有活血祛瘀，通經止痛的功效[3]，目前國內外關于丹參的輔助降血脂、提高耐缺氧、對化學性肝損傷有輔助保護和抗氧化等功能研究較多，而對其增加骨密度方面的功效研究較少。丹參作為活血化瘀的中藥，能改善微循環，目前已有網絡藥理學研究表明丹參可通過多條通路直接或間接參與細胞分化和凋亡、氧化應激、炎癥反應等影響骨代謝[4-5]，在傳統的中醫藥實踐方面，中藥材通常采用水提煎煮的方式進行，丹參的水溶性成分具有強抗氧化性，可起到預防動脈粥樣硬化[6]、保護心血管[7]等作用，成為丹參提取物研究的主要熱點之一。近年來，研究發現丹參水溶性成分可通過促進成骨細胞增殖、分化和表達[8-9]、促進骨膠原合成[10]、促進骨鈣素生成[11]來促進骨形成，亦可通過抑制抗酒石酸酸性磷酸酶活性[12]、抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路[13]、抑制腫瘤壞死因子-α 的表達[14]來抑制骨吸收[15]，還能通過調節骨髓微循環[16]、調節脂質代謝[17]等調節骨代謝。前期已有學者采用去卵巢模型研究丹參水提物對牙槽骨的影響[18-19]，取得了積極的結果。本研究以丹參水提物為研究對象，采用去卵巢大鼠為模型，通過觀察股骨質量、股骨及脛骨骨小梁形態學變化，探討丹參提取物對骨代謝的影響，以期為丹參用于開發增加骨密度的功能性食品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

基礎飼料、實驗大鼠：斯貝福（北京）生物技術有限公司[許可證號為SCXK（京）2016-0002]；水合氯醛（>99%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣液、β-雌二醇：北京索萊寶生物科技有限公司；青霉素：華北制藥廠；丹參：市售。

FA2004 型分析天平：METTLER TOLEDO 公司；TDL-8002 恒溫水浴鍋：天津市中環實驗電爐有限公司；SX-2-8-12 馬弗爐：沈陽長白電爐廠；Olympus CKX41顯微鏡：日本奧林巴斯株式會。

1.2 提取物制備

丹參提取物制備方法：稱取丹參（符合2020 版《中華人民共和國藥典》一部標準），采用水提方式提取，工藝為料液比1 ∶8（kg/L），提取3 次，過濾，合并提取液，濃縮，干燥制得丹參提取物，每克丹參提取物相當于丹參生藥2.86 g。

1.3 實驗動物的選擇

實驗選用健康雌性3月齡SPF 級SD 大鼠，體質量250～300 g，飼養于天津科技大學實驗動物中心。飼養環境：（23±3）℃，相對濕度55%～75%，12 h 明暗循環。大鼠被放置在白色塑料籠中，每籠4 只，每組2 籠。實驗期間為動物提供充足的食物和水。本研究的所有實驗程序均按照天津科技大學動物實驗倫理委員會批準的方案進行。

1.4 分組與模型的建立

將SD 大鼠隨機分為6 組，每組8 只，分別為假手術組（sham operation，SHA）、模型組（model，MOD）、丹參提取物低劑量組（Salvia miltiorrhizaextract low-dose，SL）、丹參提取物中劑量組（Salvia miltiorrhizaextract medium-dose，SM）、丹參提取物高劑量組（Salvia miltiorrhizaextract high-dose，SH）、雌激素組（estrogen，E2）。大鼠適應性喂養1 周之后進行建模，向大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，腹部固定于鼠板上，于肋緣與脊柱交界處向下備皮，在離脊柱約1 cm 處切開皮膚，剝開肌肉組織，用止血鉗拉出游離的脂肪組織，找到粉紅色的卵巢，在其與子宮連接處用3 號線結扎，剪去卵巢組織，止血，并向腹腔內滴入青霉素注射液，再做肌層、皮膚的縫合。假手術組僅摘除卵巢附近的脂肪組織。各組大鼠單籠飼養，術后3 d 腹腔注射青霉素注射液，術后1 周進行陰道圖片檢查，確認卵巢完全摘除，卵巢摘除不完全者棄用。實驗模型建立并恢復1 周后開始給藥。根據前期預實驗結果，假手術組和模型組每天灌胃等量的生理鹽水，SL、SM、SH 組每天分別灌胃63、83 mg/kg 和107 mg/kg 的丹參提取物，雌激素組每天灌胃1 mg/kg β-雌二醇。各實驗組連續給藥12 周。

1.5 體質量和攝食量記錄

體質量及攝食量自給藥開始后進行記錄，其體質量每周稱量1 次，共計12 周，攝食量每天測量1 次并記錄。觀察各組攝食量與給藥前后體質量的變化。

1.6 子宮系數測定

大鼠處死前12 h 進行斷水斷糧，處死后，將大鼠子宮上附著的脂肪剝離干凈，吸取多余液體后稱量子宮質量，計算子宮系數，觀察各組子宮系數的變化，計算公式如下。

X=U/W×1 000

式中：X為子宮系數，g/kg；U為子宮質量，g；W為大鼠體質量，g。

1.7 股骨計量學指標

股骨濕重：剝離大鼠右側股骨，將附著的肌肉和筋膜剔除干凈，吸取多余液體后用天平進行稱量。

股骨干重：將剝離的大鼠右側股骨脫脂72 h，隨后在100 ℃環境中烘干8 h，并置于干燥器中放置30 min后進行稱量。

股骨灰重：取烘干后的股骨，放入550 ℃馬弗爐中8 h，取出后置于干燥器中冷卻，精密稱定股骨的灰重。

1.8 形態學觀察

參照趙恒俠等[20]的研究方法，分別取大鼠左側脛骨、股骨,除凈周圍附著的肌肉和筋膜組織，然后將骨組織置于10%福爾馬林溶液中固定，EDTA 脫鈣預處理后進行脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色、封片等步驟，分別獲得大鼠股骨和脛骨切片。最后，通過光學顯微鏡采集圖片，觀察脛骨和股骨的骨小梁損傷程度。

1.9 統計學分析

本實驗統計方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，結果均以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）評估各組間差異，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 體質量與攝食量

各組大鼠體質量自開始給藥時進行記錄，各組結果見表1。

表1 各組大鼠給藥前后體質量及攝食量Table 1 Body weight and food intake of rats in each group g

如表1所示，初始體質量各組間沒有顯著差異（P＞0.05），平均攝食量各組間無統計學差異（P＞0.05）。12周后體質量與SHA 組比較，MOD 組體質量極顯著增加（P＜0.01），較SHA 組增加23.45%。與MOD 組比較，SL、SM、SH 與E2 組體質量均顯著降低（P＜0.05），較模型組分別降低了7.98%、8.58%、9.57%、10.38%，說明丹參提取物能抑制去卵巢大鼠體質量的增加。

2.2 子宮系數

各給藥組對去卵巢大鼠子宮系數的影響結果如圖1所示。

圖1 不同受試物對去卵巢大鼠子宮系數的影響Fig.1 Effects of different drugs on uterine coefficients of ovariectomized rats

由圖1 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 組的子宮系數分別為2.15、0.93、1.42、1.78、2.06、2.73 g/kg。與SHA 組比較，MOD、SL、SM 組的子宮系數顯著降低（P＜0.05），較假手術組分別降低了57.02%、33.94%、17.25%，E2 組較假手術組顯著升高了26.50%（P＜0.05），SH 組與SHA 組無顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組比較，SL、SM、SH 組和E2 組子宮系數均顯著升高（P＜0.05），分別升高了18.24%、60.19%、63.73%和194.29%，且觀察到丹參提取物給藥劑量與子宮系數的增加呈正相關。與E2 組比較，丹參提取物各劑量組均顯著降低（P＜0.05）。綜上，丹參提取物各劑量組均可改善去卵巢大鼠的子宮系數，并且對子宮的刺激作用明顯小于雌激素，而雌激素對子宮有明顯的刺激作用。

2.3 股骨計量學指標

各給藥組對股骨濕重、股骨干重和股骨灰重的影響結果如圖2所示。

圖2 不同受試物對去卵巢大鼠股骨濕重、干重和灰重的影響Fig.2 Effects of different drugs on the wet weight，dry weight，and ash weight of femur in ovariectomized rats

由圖2A 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 組的股骨濕重分別為1.22、1.02、1.10、1.15、1.16、1.24 g。與SHA組比較，MOD、SL 組股骨濕重顯著降低（P＜0.05），分別降低了15.91%、9.65%，SM、SH 組和E2 組均無顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組比較，SL、SM、SH 組和E2 組的股骨濕重均顯著升高（P＜0.05），分別升高了7.45%、12.45%、13.31%和20.76%，且隨著丹參提取物劑量增加，股骨濕重也逐漸增加。與E2 組比較，SM、SH 組無顯著差異（P＞0.05），表明丹參提取物中、高劑量對股骨濕重的增加與雌激素相當，且接近SHA 組。

由圖2B 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 各組的股骨干重分別為0.72、0.52、0.62、0.66、0.64、0.69 g，與SHA組比較，MOD、SL、SH 組的股骨干重顯著降低（P＜0.05），較SHA 分別降低27.97%、13.29%、10.31%，SM 和E2組均無顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組相比，各給藥組的股骨干重均顯著升高（P＜0.05），SL、SM、SH 和E2組的股骨干重較MOD 組分別升高20.38%、27.91%、24.51%和33.50%。與E2 組比較，SL、SM、SH 組均無顯著差異（P＞0.05），表明丹參提取物各劑量組對股骨干重的增加效果與雌激素相當。

由圖2C 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 各組的股骨灰重分別為0.43、0.31、0.36、0.37、0.39、0.42 g。與SHA 組比較，MOD、SL、SM 和SH 組的股骨灰重均顯著降低（P＜0.05），較SHA 組分別降低27.65%、15.59%、13.24%、8.24%，E2 組無顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組相比，SL、SM、SH 和E2 組的股骨灰重均顯著升高（P＜0.05），各組灰重較MOD 組分別升高16.67%、19.92%、26.83%和35.37%，且丹參提取物給藥劑量與股骨灰重的增加呈正相關（P＜0.05）。與E2 組比較，SL、SM 組有顯著差異（P＜0.05），SH 組無顯著差異（P＞0.05）。

綜上，丹參各組均可增加去卵巢大鼠股骨濕重、股骨干重和股骨灰重，丹參提取物中劑量組和高劑量組對股骨濕重的增加效果與雌激素相當，且已接近假手術組。

2.4 骨形態學觀察

股骨形態學結果如圖3所示，脛骨形態學結果如圖4所示。

圖3 不同受試物對去卵巢大鼠股骨形態學影響Fig.3 Effects of different drugs on the morphology of femur in ovariectomized rats

圖4 不同受試物對去卵巢大鼠脛骨形態學影響Fig.4 Effects of different drugs on the morphology of tibia in ovariectomized rats

由圖3 可知，SHA 組顯示骨組織形態正常，股骨骨小梁密集，結構連接成網狀，排列致密有序，粗細均勻，基本結構未見異常；MOD 組骨組織形態出現明顯病理學改變，表現為骨小梁稀疏，斷裂，排列紊亂，結構模糊，并可見游離末端；不同給藥組股骨骨組織形態學變化較模型組均有明顯改善，各給藥組骨小梁無明顯斷裂，排列尚規則，且寬度接近正常，表明丹參各給藥組和雌激素組均可以改善去卵巢大鼠股骨骨小梁結構。

由圖4 可知，SHA 組顯示骨組織形態正常，脛骨骨小梁密集，結構連接成網狀，排列致密有序，粗細均勻，基本結構未見異常；MOD 組骨組織形態出現明顯病理學改變，表現為骨小梁稀疏，斷裂，排列紊亂，結構模糊，并可見游離末端；不同給藥組脛骨骨組織形態學變化較模型組均有明顯改善，可看出各給藥組骨小梁無明顯斷裂，排列尚規則，且寬度接近正常，表明丹參各給藥組和雌激素組均可以改善去卵巢大鼠脛骨骨小梁結構。

3 討論與結論

去卵巢模型大鼠由于體內雌激素水平降低，骨代謝呈負平衡狀態，骨吸收相對增強，骨量逐漸丟失，形成骨質疏松，去卵巢動物的體質量快速增長是為抵抗去卵巢后對骨骼影響的一種自身保護性反應，可以部分抑制模型大鼠的骨量丟失。股骨干重、濕重、灰重的降低，骨小梁的斷裂，也直接反映了去卵巢模型骨量的丟失[21]。本研究發現，與去卵巢模型組大鼠比較，不同劑量的丹參提取物均能顯著降低大鼠體質量、改善大鼠的子宮系數、增加股骨濕重、干重和灰重（P＜0.05），并且能夠改善股骨及脛骨骨小梁結構，此外，與假手術組比較，雌激素組的子宮系數顯著增加（P＜0.05），而前期也有研究表明長期使用雌激素對生殖系統造成損害[22]，本研究結果也進一步印證了長期使用雌激素可對子宮會產生強刺激，從而導致誘發嚴重疾病的可能性，而丹參各組對子宮的影響要明顯弱于雌激素組（P＜0.05），這也就表明雖然丹參存在雌激素樣作用，但對子宮的刺激明顯減小。除了去卵巢動物模型外，丹參也對糖皮質激素模型引起的骨質疏松同樣有效[23-24]，說明丹參可對不同類型的骨質疏松起到增加骨密度的作用。綜上所述，丹參提取物可提高去卵巢大鼠骨質量，改善骨微結構，且對子宮刺激作用小，對緩解骨質疏松具有積極作用，對股骨濕重的增加與雌激素相當且接近于假手術組，表明丹參提取物具有增加骨密度的功效。