膳食GM1對AD小鼠神經節苷脂代謝的調控作用

劉斌，王志高，王曉旭，馬迎旭，叢培旭，宋雨，徐杰，薛長湖

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003）

神經節苷脂（gangliosides，GLS）是含有唾液酸的鞘糖脂類化合物，其中帶負電荷的親水聚糖頭基與疏水性神經酰胺（ceramide，Cer）尾部相連[1]。糖鏈中糖組成和結構的變化與脂質部分的長度、飽和度和羥基化賦予了GLS 廣泛的多樣性，目前，已經發現了數百種GLS 分子種類[2]。GLS 高度集中在中樞神經系統（central nervous system，CNS）中，在記憶形成、神經發生、突觸傳遞和其他神經功能中發揮重要作用，并與細胞識別、細胞信號傳導以及離子通道調節等生物學功能密切相關[3]。研究表明GLS 的數量和種類在細胞分化過程中會發生變化[4]，鑒于內源性GLS 在神經方面的重要功能，對GLS 的定量分析顯得十分必要。

單唾液酸四己糖神經節苷脂（monosialotetrahexosyl ganglioside，GM1）是CNS 中最豐富的一類GLS，存在于神經元和神經膠質細胞的質膜中[1]，具有調節離子轉運、神經元分化、神經保護信號傳導的作用[5]。研究發現，通過外源攝入GM1可改善氯胺酮誘導的大鼠認知障礙和海馬細胞凋亡[6]；在體外神經干細胞中，GM1干預減輕了丙泊酚與瑞芬太尼誘導的神經毒性[7]，表明外源GM1在神經損傷和神經變性的體內外模型中展現出神經保護作用。隨著GLS 在維持大腦認知功能的重要性日益顯現，其膳食來源越來越被重視。GLS 存在于蛋、肉等動物源食品中[8]，其中哺乳動物的腦組織是GM1的重要來源，目前國內外主要從豬腦、牛腦等食用腦中進行提取和分離純化[9]。

阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一類進行性神經退行性疾病，與神經元進行性喪失有關，主要癥狀是記憶和認知功能下降[10]。AD 在老齡化人群中患病率高，且暫無治愈的方法。在AD 體內外模型中，外源GM1表現出良好的神經保護作用[11-12]。淀粉樣蛋白和人早老蛋白1（APPswe/PS1dE9，APP/PS1）雙轉基因小鼠攜帶嵌合的淀粉樣蛋白前體蛋白和突變的人早老蛋白1，具有AD 的神經行為功能障礙[13]，是探究GM1對AD 作用的良好模型。AD 患者體內GLS 水平顯著改變[14]，推測GLS 代謝的改變可能反映AD 的發病進程，與AD 發病機制有關，然而過往因技術受限無法精確定量。三重四極桿結合多級反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式能夠靶向研究GLS 代謝，進而為預防與治療AD 提供策略[15]。液相色譜-質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）能夠對生物樣本中GLS 進行準確的定量分析[16]。因此本研究采用APP/PS1 小鼠作為AD 模型，基于LC-MS 方法結合分子生物學手段，探究膳食GM1對AD 小鼠內源GLS 代謝的影響及機制，以期為GM1在食品和藥品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF 級APP/PS1 雄性小鼠以及同窩野生型雄性小鼠（C57BL/6J，5月齡，體重20～25 g）：北京唯尚立德生物科技有限公司。

冰凍豬腦：杭州慧康食品有限公司；氯仿、甲醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、異丙醇（均為色譜級）：美國Thermo Fisher 公司；GM1、二唾液酸四己糖神經節苷脂（disialotetrahexosyl ganglioside，GD1）、三唾液酸四己糖神經節苷脂（trisialotetrahexosyl ganglioside，GT1）、四唾液酸四己糖神經節苷脂（tetrasialotetrahexosyl ganglioside，GQ1）標準品：美國Cayman Chemical 公司；氘代神經節苷脂d3-GM3：美國Avanti Polar Lipids 公司；ACQUITY UPLC BEH 液相色譜柱（150 mm×1 mm，1.7μm）：美國Waters 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白定量試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司；OMEGA 總DNA/RNA/蛋白質共提取試劑盒：廣州飛揚生物工程有限公司；5×All-In-One MasterMiX 逆轉錄試劑盒：美國Abcam 公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MED-VWM Morris 水迷宮裝置：上海贊德儀器有限公司；Ultimate 3000 RSLCnano 液相系統、Nanodrop 2000 超微量分光光度計：美國Thermo Scientific 公司；4000Q TRAP 三重四極桿線性離子阱質譜儀：美國SCIEX 公司；iCycler iQ5 系統實時熒光定量聚合酶鏈式反應擴增儀：美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 豬腦中GM1的提取

參考孫玉[17]的方法，略作修改，冷凍豬腦解凍后用氯仿∶甲醇∶水體系（4 ∶8 ∶3，體積比）提取，攪拌后離心（4 ℃，30 min，2 000×g）后收集上清液，隨后加水調整體系為氯仿∶甲醇∶水=4 ∶8 ∶5.6（體積比），離心（4 ℃，30 min，2 000×g）后取上清過Daisogel-SP120-C8 色譜柱（3.5 cm×20 cm，40～60 μm）脫鹽，回收的神經節苷脂重新溶解在氯仿∶甲醇∶水（30 ∶60 ∶8，體積比）中，并于DEAE-Sephadex A25 色譜柱（1.7 cm×45 cm，40～120 μm）梯度洗脫，最后使用電噴霧電離-串聯質譜進行鑒定，GM1純度大于90%。

1.3.2 實驗動物分組與受試

8 只C57BL/6J 小鼠和16 只APP/PS1 小鼠適應性喂養7 d 后，分為3 組（n=8），正常組：C57BL/6J 小鼠，飼喂AIN-93G 標準飼料；模型組：APP/PS1 小鼠，飼喂AIN-93G 標準飼料；GM1組：APP/PS1 小鼠，飼喂AIN-93G 標準飼料+50 mg/（kg·d）GM1。所有小鼠實行雙水瓶喂養，保證有足夠的活動空間，持續喂養3 個月后進行各項指標的檢測。所有程序在中國海洋大學動物倫理委員會批準的協議基礎上進行。

1.3.3 Morris 水迷宮行為學分析

水迷宮中加入白色素鈦白粉，水溫設定為（22±1）℃。將水迷宮分為4 個象限，平臺放置在任一象限中點并淹沒在水面下方約1 cm 的位置。定位航行實驗中首先訓練所有小鼠經過4 條路徑找到平臺，每個實驗日將小鼠放置在水池中開始尋找試驗。記錄小鼠找到平臺的時間即為逃逸潛伏期，若逃逸潛伏期超過60 s則記為60 s。最后一天進行空間探索測試：移出平臺，小鼠在泳池內自由游泳60 s，記錄小鼠在目標象限停留的時間及穿越平臺位置的次數。

1.3.4 小鼠腦皮質中神經節苷脂的提取

基于Svennerholm 等[18]的方法進行神經節苷脂的提取。取小鼠腦皮質，添加9 倍體積超純水，冷凍研磨配制成10%組織勻漿液。根據BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，吸取等量蛋白含量對應的組織勻漿液，利用超純水調整至相同體積。加入20 倍體積的氯仿∶甲醇（1 ∶2，體積比）和氘代內標渦旋振蕩，離心（4 ℃、20 min、2 000×g）取上層清液，加水調整溶劑體系至氯仿∶甲醇∶水為4 ∶8 ∶5.6（體積比），離心（4 ℃、20 min、2 000×g）收集上層水相即得到神經節苷脂粗提物。氮氣吹干后重新溶解在氯仿∶甲醇∶水（30 ∶60 ∶8，體積比）中，并于DEAE-Sephadex A25 色譜柱（6 mm×45 mm）梯度洗脫。

1.3.5 LC-MS 法分析小鼠腦皮質中神經節苷脂

基于Ikeda 等[19]的方法，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜檢測皮質中的神經節苷脂，樣品在C18 柱（150 mm×0.3 mm）上分離。流速為7.5 μL/min，柱溫為45 ℃。流動相由流動相A：甲醇∶異丙醇∶水（55 ∶25 ∶20，體積比），200 mmol/L 乙酸銨和流動相B：甲醇∶異丙醇∶水（60 ∶40，體積比）組成。梯度洗脫程序：0～5 min，A；5～50 min，B；35 min，B。使用電噴霧離子源，在負離子模式下進行MRM 掃描，范圍為m/z200～2 300，噴霧電壓為-4 500 V。標準品GM1、GD1、GT1和GQ1的碰撞誘導解離（collision induced dissociation，CID）分別為-95、-55、-60、-60 eV。生物樣本中的GLS采用與GLS 標準品結構相近的CID 進行檢測。

1.3.6 神經節苷脂代謝通路相關基因mRNA 表達水平檢測

采用OMEGA 總DNA/RNA/蛋白質共提取試劑盒從小鼠皮質中提取RNA，Nanodrop 分光光度計測定RNA 濃度后使用5×All-In-One MasterMiX 試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA，加入2×SYBR Green qPCR Master Mix 和上下游引物后對目的基因進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。以β-肌動蛋白作為內參，使用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達水平。使用的引物序列如表1所示。

1.4 數據處理與統計分析

脂質數據由Agilent MassHunter Quantitative Analysis 軟件分析，使用內標校正的外標曲線對GLS 進行定量分析。所有數據表示為平均值±標準差。由Graphpad prism 8.0 作圖和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 GM1 對APP/PS1 小鼠行為學的影響

采用Morris 水迷宮觀測分析GM1對APP/PS1 小鼠空間學習與記憶能力的作用，結果見圖1。

圖1 GM1 對APP/PS1 小鼠行為學的影響Fig.1 Effect of GM1 on the behaviors of APP/PS1 mice

AD 小鼠存在學習與記憶障礙，顯著的行為學特征是定向失常和運動記憶缺陷，由圖1A 可知，第1 天到第5 天正常組小鼠逃逸潛伏期逐漸降低，第5 天模型組小鼠與正常組小鼠的逃避潛伏期差異高度顯著（p＜0.001），表明APP/PS1 小鼠的空間學習能力受損；GM1干預小鼠與模型組小鼠相比逃避潛伏期高度顯著降低（p＜0.001），表明GM1改善了APP/PS1 小鼠的空間學習能力。由圖1B～圖1D 可知，在空間探索試驗中，模型組小鼠穿越平臺次數及在目標象限停留時間與目標象限停留時間百分比與正常組相比均高度顯著下降（p＜0.001），在GM1干預下，APP/PS1 小鼠的穿越平臺次數、目標象限停留時間及百分比高度顯著增加（p＜0.001）。表明GM1高度顯著改善了APP/PS1 小鼠的記憶能力。與Yang 等[20]的研究結果一致，表明外源GM1具有緩解AD 病癥的作用，對認知功能產生了積極影響。

2.2 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質GLS 組成的影響

GLS 分類：按照Cer 中不飽和鍵數量，分為飽和脂肪酸GLS（saturated fatty acid-gangliosides，SFA-GLS）、單不飽和脂肪酸GLS（monounsaturated fatty acid-gangliosides，MUFA-GLS）和多不飽和脂肪酸GLS（polyunsaturated fatty acid-gangliosides，PUFA-GLS）；根據鏈長分類，包括長鏈脂肪酸GLS（long chain fatty acid-gangliosides，LCFA-GLS）和超長鏈脂肪酸GLS（very long chain fatty acid-gangliosides，VLCFA-GLS）；根據外部唾液酸羥基是否被乙酰化，可分為非乙酰化GLS（non-O-acetylation-gangliosides，non-OAc-GLS）和乙酰化GLS（O-acetylation-gangliosides，OAc-GLS）。LC-MS 分析小鼠腦皮質中GLS 水平情況見表2。

表2 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質神經節苷脂含量的影響Table 2 Effects of GM1 on the contents of ganglioside in the cortex of APP/PS1 mice μg/mg 蛋白

GLS 水平的降低和特定GLS 相對豐度的變化可能在AD 中發生[21]。如表2所示，模型組總GLS 含量高度顯著下降（p＜0.001）。GM1組總GLS 含量高度顯著提高（p＜0.001）。

正常組小鼠以碳鏈組成為C36：1 和C38：1 的MUFA-GLS 為主，占總GLS 含量的59.6%。其次為SFA-GLS，最后為PUFA-GLS。與正常組相比，模型組中MUFA-GLS 和SFA-GLS 含量高度顯著降低（p＜0.001），GM1受試具有高度顯著回調作用（p＜0.001）。相較于正常組，模型組小鼠的PUFA-GLS 含量極顯著升高（p＜0.01），GM1干預有顯著降低作用（p＜0.05）。

由表2 可知，正常組小鼠中絕大多數以LCFA-GLS為主，占總GLS 含量的99.2%。模型組中LCFA-GLS和VLCFA-GLS 含量均高度顯著下降（p＜0.001），攝食GM1后LCFA-GLS 含量高度顯著上調（p＜0.001），VLCFAGLS 含量顯著升高（p＜0.05）。乙酰化會導致GLS 的生理性質發生重大變化，正常組中non-OAc-GLS 和OAc-GLS 兩種GLS 含量水平相當。與正常組相比，模型組中non-OAc-GLS 和OAc-GLS 含量均高度顯著降低（p＜0.001），GM1干預有高度顯著回調作用（p＜0.001）。這與Fukami 等[14]的研究結果一致，AD 模型中的多數GLS含量降低，但外源GM1能夠恢復GLS 總含量，并對不同飽和度、鏈長與乙酰化的GLS 含量展現出顯著的調控效果。

利用LC-MS 對不同亞類的GLS 進行考察，結果見表3。

表3 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質神經節苷脂亞類量的影響Table 3 Effects of GM1 on the content of ganglioside subclass in the cortex of APP/PS1 mice μg/mg 蛋白

由表3 可知，共檢測到19 個亞類GLS，根據唾液酸數量可以分為5 類。單唾液酸GLS 包括GM1a和GM3，與正常組相比，模型組中GM1a和GM3含量均高度顯著上調（p＜0.001），攝入GM1能夠調控二者含量下降，回歸到正常組水平。雙唾液酸GLS 包括7 種GLS亞類。除GD1b和GD2以外，與正常組相比，APP/PS1 小鼠中雙唾液酸GLS 含量趨于減少，經GM1干預后趨于升高，其中在GD1a、GD3和OAc-GD1b中調控效果高度顯著（p＜0.001）。三唾液酸GLS 包括4 種GLS 亞類，其中GT1b和di-OAc-GT1b含量在模型組小鼠中高度顯著下降（p＜0.001），GM1干預后GT1b 含量高度顯著上調（p＜0.001），di-OAc-GT1b含量極顯著升高（p＜0.01）。同樣在四唾液酸GLS 和五唾液酸GLS 組成中，與正常組相比，模型組小鼠GLS 含量高度顯著降低（p＜0.001），GM1干預后將其恢復至正常水平。總的來說，在APP/PS1 小鼠皮質中，簡單GLS（GM1a和GM3）水平有所增加，復雜GLS 趨于減少，而攝食GM1逆轉了這一變化。

2.3 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質中GLS 分子種的影響

GM1對APP/PS1 小鼠腦皮質中GLS 分子種的影響見圖2。

圖2 GM1 對APP/PS1 小鼠腦皮質中GLS 分子種的影響Fig.2 Effect of GM1 on GLS molecular species in the cortex of APP/PS1 mice

分層聚類分析結果表示不同組間GLS 的變化情況，由圖2A 可知，與正常組相比，模型組的GLS 水平顯著變化，而攝食GM1能部分改善其水平。為了進一步研究正常組和模型組之間的GLS 差異，火山圖分析被用來篩選脂類生物標志物。用≥1 或≤-1 的log2（FC）值區分兩組的GLS 種類。由圖2B 可知，模型組中4 種GLS 分子種發生了顯著上調，包括GM1（38：1）、GD1-GalNAc（36：2）、GD1a（40：2）、GD1a（42：3），它們可能是AD 潛在病理變化的重要生物標志物。

2.4 GM1 對APP/PS1 小鼠GLS 代謝通路的影響

采用RT-qPCR 測定GLS 合成及分解基因的mRNA 表達水平，結果見圖3。

圖3 GM1 對APP/PS1 小鼠GLS 合成及分解基因的mRNA 表達水平的影響Fig.3 Effect of GM1 on mRNA levels of genes involved in GLS synthesis and catabolism in APP/PS1 mice

唾液酸和糖基的組裝與轉移對GLS 合成起關鍵作用，st3gal5、st8sia1、b4galnt1、b3galnt4、st3gal2和soat是編碼糖基轉移酶和唾液酸乙酰酯酶的基因[22-23]，如圖3A所示，與正常組相比，模型組小鼠腦皮質中除b4galnt1外，其余GLS 合成基因mRNA 水平趨于降低，其中st3gal5、st8sia1極顯著降低（p＜0.01），GM1干預后的mRNA 水平均高度顯著回升（p＜0.001），從而促進GLS含量升高，與LC-MS 檢測結果相吻合。soat和siae分別促進與抑制OAc-GLS 的生成[22]。由圖3A 和圖3B可知，與正常組相比，模型組中soat和siae基因mRNA水平均有所下降，其中soat的mRNA 水平顯著降低（p＜0.05），經GM1干預后，兩種基因的mRNA 水平有所回升，soat基因表達水平上調高度顯著（p＜0.001），表明GM1攝入能夠活躍OAc-GLS 代謝過程，且趨向于OAc-GLS 的合成。由圖3B 可知，在GLS 分解的基因g1b1、hexa、siae中，攝食GM1后，hexa基因的表達水平高度顯著下調（p＜0.001），與Okuda 等[24]的結果一致，hexa基因mRNA 水平的降低阻礙了復雜GLS 的降解，進一步佐證了LC-MS 分析的結果。推測APP/PS1小鼠攝食GM1經消化吸收后，促進GLS 合成，進而穿越血腦屏障[25]，到達大腦中樞神經系統對AD 起調控作用。

3 結論

本研究對攝食GM1的AD 小鼠內源性GLS 的代謝調控機制進行研究，結果表明，GM1通過維持GLS代謝平衡進而緩解AD 病癥。首先行為學的結果表明攝食GM1可以改善APP/PS1 小鼠的空間學習與記憶障礙。其次，針對GM1的外源干預探究內源性GLS 的變化規律，通過LC-MS 檢測分析發現模型組小鼠腦皮質GLS 總含量與多數復雜GLS 趨于減少，GM1回調GLS總水平與亞類水平。進一步對GLS 分子種的分析發現，較正常組相比模型組小鼠腦皮質GLS 分子種發生明顯變化，GM1部分改善了這些變化，其中4 種GLS分子種被鑒定為AD 的潛在生物標志物。LC-MS 的結果表明GLS 作為控制神經元功能的重要角色參與了AD的病理過程，GM1具有緩解GLS 水平異常的作用。最后，借助RT-qPCR 分析GM1調控GLS 代謝機制中發現，GM1攝入能夠促進GLS 合成和抑制GLS 分解，從而調控APP/PS1 小鼠腦皮質中GLS 代謝，并進一步印證了上述GLS 的水平變化。

綜上所述，膳食GM1能顯著提高APP/PS1 小鼠的空間學習與記憶能力，改善效果與回調腦皮質中GLS水平密切相關，其機制可能是促進GLS 合成代謝。本研究可為GM1在功能性食品、藥品領域的應用提供一定的理論參考。