肺動脈平滑肌細胞外泌體上調miR-106b-5p增強肺動脈內皮細胞Warburg效應促進動脈型肺動脈高壓的分子機制

艾麗菲熱·買買提 高靜 于子翔 馬依彤

1新疆醫科大學第一附屬醫院冠心病一科（烏魯木齊 830054）；2新疆醫科大學第五附屬醫院內分泌科（烏魯木齊 830000）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）的定義為個體在靜息狀態下平均肺動脈壓為25 mmHg或以上。臨床上，PH分為五大類，其中第一大類為動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH），指的是因肺血管疾病所致的PH，是一種預后較差的慢性疾病［1］。PAH 是一種以心肺為單元的疾病，其特征是肺動脈高壓下阻塞性肺血管重塑增加右心室后負荷，導致右心室肥厚和衰竭［2-3］。全球范圍內成人PAH 的發病率為2.0 ～ 7.6 例/100 萬人年，患病率為11 ～ 26 例/100 萬人年［4］。我國PAH 患者普遍面臨著診斷延誤、治療不規范，醫療經濟負擔和心理負擔重的問題［5］。迫切需要開發新的有效篩選和治療PAH 的醫療策略。

目前臨床上治療PAH 的藥物主要是利尿劑和肺血管擴張劑，以及使用靶向藥物。雖然可以改善患者的肺功能和血流動力學，但它們僅可改善癥狀，卻無法治愈疾病和降低死亡率。PAH 的5 年死亡率仍約為50%［6］。肺動脈高壓的病變過程涉及肺動脈內皮細胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）、肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）等發生癌樣增殖、抗凋亡、類癌表型（包括上皮-間質轉化和纖維化等）轉化等［7］。其中相關細胞所發生的代謝重編程類似于在腫瘤細胞中被廣泛研究的Warburg效應［8］。然而是什么導致了這些細胞在缺氧和炎癥狀態下，能量代謝途徑發生轉換，尚未知曉。這是阻遏PAH 血管相關細胞癌樣病變的關鍵和靶向藥物開發的重點。在癌癥相關領域的研究表明microRNAs（miRNAs）是調控癌細胞Warburg 效應的重要參與者之一［9］。且在PAH 的肺血管重塑過程中，肺血管細胞間可通過外泌體（exosomes）相互溝通，加速疾病進展［10］。因此在該研究中，擬對健康對照組和PAH 患者外周血漿中的外泌體進行分離純化，并對其內的miRNAs 進行微陣列測定和差異表達分析，以期發現PAH 相關的核心miRNAs分子，并探討在PASMCs 與PAECs 的胞間通訊的外泌體中此miRNAs 分子的關鍵作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 原代人肺動脈平滑肌細胞（hPASMCs）和原代人肺動脈內皮細胞（hPAECs）購自上海名勁生物（中國）。總外泌體分離試劑盒（4484450），外泌體-人CD63 分離試劑盒（內含超順磁性 Dynabeads）（10606D），mirVana? miRNA 分離試劑盒（不含苯酚）（AM1561），GeneChip miRNA 4.0 Array（902446），兔抗人CD63單抗（PA5-96217），兔抗人β-tubulin 多抗（PA1-16947），兔抗人USP32多抗（PA5-60690），兔抗人PKM2多抗（PA5-28700），兔抗人GLUT1 多抗（PA1-46152），兔抗人HK2 多抗（PA5-29326），兔抗人LDHA 多抗（PA5-27406），兔抗人GAPDH 多抗（PA1-988），miR-106b-5p mimic和其對照組miR-NC（4464066），miR-106b-5p inhibitor 和其對照組Inhibitor-NC（AM10067）購自Thermo Fisher（美國）。PKM2 ORF 上、下游引物，shRNA-NT，PKM2 shRNA 委托上海生工生物科技有限公司（中國）代為合成。

1.2 方法

1.2.1 PAH 患者血漿樣本的采集 招募2022 年3 - 5 月期間被我院診斷為PAH 并住院治療的患者（n= 10，男4 例，女6 例）參加本項目的研究。同時招募未接受任何藥物治療的健康個體（n= 9，男5 例，女4 例）作為健康對照（healthy controls，HC）納入本次研究，并與PAH 患者在同一時間采集外周靜脈血樣本。本次研究得到了我院倫理委員會的批準（審批號：20220113-08），并根據《赫爾辛基宣言》的倫理原則進行。采用（3.8%）檸檬酸抗凝管采集PAH 患者和HC 個體外周靜脈血5 mL。分離上層血漿，約2 mL/樣本，凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 外泌體囊泡的分離與鑒定 取1 mL 血漿樣本，使用總外泌體分離試劑盒分離血漿中的總外泌體。具體分離方法參見試劑盒說明書進行即可。分離獲得外泌體顆粒懸液后，使用外泌體-人CD63 分離試劑盒（內含超順磁性 Dynabeads）進一步富集CD63+外泌體。

1.2.3 外泌體miRNAs 的純化 取100 μL CD63+外泌體樣品，使用mirVana? miRNA 分離試劑盒（不含苯酚）分離其中的miRNAs，具體操作按照試劑盒的說明書進行。

1.2.4 外泌體miRNAs 的微陣列測定和差異表達分析（MicroArray analysis） 外泌體miRNAs 的微陣列測定和差異表達分析，委托北京諾禾致源科技有限公司（中國）代為進行。微陣列芯片使用GeneChip miRNA 4.0 Array（902446）。使用R語言中的46ip miRNA 4.軟件包，采用實驗性貝葉斯法調節后的t-檢驗（an empirical Bayes moderatedt-test）進行分析，使用“進行分atmap （v1.0.12）”軟件包生成熱圖。

1.2.5 生物信息學分析miR-106b-5p 與USP32 的序列互作 通過TargetScanHuman （v7.2） （網頁版）（https：//www.targetscan.org/vert_72/）進行miR-106b-5p 與USP32 的序列互作分析。

1.2.6 細胞培養 hPASMCs 和hPAECs 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養液中。細胞置于37 ℃恒溫濕潤的CO2孵育箱中維持培養。腺病毒轉染hPASMCs 48 h 后，收集并測定細胞上清液外泌體中miR-106b-5p 的表達水平，確認轉染成功后，建立hPASMCs 和hPAECs 的共培養體系。hPASMCs 培養于24-孔板下層細胞培養皿中，hPAECs 培養于上層細胞小室，細胞培養液連通兩種細胞培養物。共培養細胞置于37 ℃恒溫濕潤的CO2孵育箱中，再培養48 h 后測定下游指標。

1.2.7 體外細胞缺氧誘導 hPASMCs 和hPAECs細胞在常氧條件下（21% O2，5% CO2，74% N2）或缺氧（4% O2，5% CO2，91% N2）條件下維持培養4 d，結束后收集細胞上清液，分離和純化其中外泌體并進行下游指標測定［11］。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因分析 使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行測定。將USP32 3′-UTR-WT（USP32 WT）或USP32 3′-UTR-MUT（USP32 MUT）克隆并連接入試劑盒自帶的pGMCMV Luciferase Reporter Plasmid 報告載體中。將1 × 105HEK 293T 細胞接種在24-孔板中，過夜培養待細胞貼壁。然后按照實驗要求，使用Lipofectamine 3000 進行共轉染。轉染48 h 后，按照試劑盒說明書的操作方法，上機酶標儀檢測熒火蟲熒光素酶活力和海腎熒光素酶活力。

1.2.9 qPCR 使用TRIzol 裂解液裂解細胞培養物。使用EasyPure RNA Kit 提取細胞總RNA，使用EasyPure miRNA Kit 提取細胞總miRNA。使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 反轉錄合成cDNA。使用TransStart Green qPCR SuperMix 進行qPCR 反應。

1.2.10 Western blot 使用RIPA 裂解液裂解細胞培養物，收集總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目標蛋白，濕轉法轉印目的蛋白至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗于4℃過夜孵育，次日孵育二抗1 h，隨后ECL 顯影呈像。

1.2.11 轉染 采用腺病毒轉染的方式敲低/過表達hPASMCs 的miR-106b-5p，或敲低/過表達hPAECs的PKM2。腺病毒過表達載體為pADV-mCMV-MCS-3xFLAG。腺病毒shRNA 沉默載體為pADV-U6-shRNA-CMV-EGFP。PKM2 ORF上游引物：5′-GGATCCAGGGCGTCTGGGATG-3′，PKM2 ORF 下游引物：5′-UGACAUACAGGUAGGCUCUA-3′。shRNANT：5′-CTGTCTCACGATAGATGGATA-3′，PKM2 sh-RNA：5′-GCTGACACATTCCTGGAGCAC-3′。委托上海和元生物進行腺病毒顆粒包裝。腺病毒轉染hPASMCs 或hPAECs 時的滴度為1010PFU/mL。轉染24 h 后進行下游指標的測定。

1.3 統計學方法 計量數據均以均數±標準差的方式表示。使用GraphPad Prism v8 軟件對數據結果進行統計學分析。組間比較，兩組間采用t檢驗，多組間采用單因素方差分析。當P＜ 0.05 時認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAH 患者血漿外泌體中miR-106b-5p 水平上調 對來自HC 和PAH 個體外周血漿分離的外泌體表面標志物CD63 的表達情況的鑒定結果，顯示兩種來源外泌體均為CD63+（圖1）。微陣列法測定上述兩種來源外泌體中前5 位顯著上調/下調的miRNAs，其中miR-106b-5p 為顯著上調的第3 位（表1）。qPCR 法測定常氧組和缺氧組hPASMCs或hPAECs 來源外泌體中miR-106b-5p 的相對表達水平，與常氧組相比，缺氧組hPASMCs 來源的外泌體中miR-106b-5p 的相對表達水平顯著上調；而hPAECs 來源的外泌體中，常氧組和缺氧組miR-106b-5p 的相對表達水平無明顯差異（表2）。

表1 PAH 患者（n = 10）血漿中前5 位顯著上調/下調的miRNAs，對照組為HC（n = 9）Tab.1 The top 5 significantly up-regulated/down-regulatedmiRNAs in the plasma of PAH patients （n = 10） and HC in the control group （n = 9）

表2 細胞上清液外泌體中miR-106b-5p 的表達水平Tab.2 Expression level of miR-106b-5p in cell culture supernatant exosomes ±s

表2 細胞上清液外泌體中miR-106b-5p 的表達水平Tab.2 Expression level of miR-106b-5p in cell culture supernatant exosomes ±s

組別常氧組缺氧組t值P值hPASMCs 1.0ECssi 7.62Cssio 34.01 0.001 hPAECs 1.0ECssi 1.07Cssio 2.38 0.072

圖1 對HC 和PAH 個體外周血漿分離的外泌體標志物的測定Fig.1 Identification of exosome marker for peripheral blood plasma separation in HC and PAH individuals

2.2 miR-106b-5p通過負調控USP32上調PKM2 通過TargetScan （v7.2）（網頁版）對miR-106b-5p 與USP32 的序列互作位點分析（圖2）。雙熒光素酶報告基因分析結果顯示，與USP32 WT 共轉染的miR-NC 組相比，與USP32 WT 共轉染的miR-106b-5p mimic 組熒光素酶報告基因相對表達水平明顯降低；而在與USP32 MUT 共轉染的miR-NC 組和miR-106b-5p mimic 組之間，熒光素酶報告基因相對表達水平無明顯差別（表3）。對hPASMCs 進行miR-106b-5p 過表達處理，然后測定與其共培養的上層hPAECs 胞內USP32 和PKM2 蛋白質的表達情況，發現與miR-NC 組相比，miR-106b-5p mimic 組USP32 的相對表達水平明顯降低；miR-NC 組和miR-106b-5p mimic 組胞內PKM2 的相對表達水平明顯上調（表4）。

表3 熒光素酶報告基因相對表達水平Tab.3 Relative expression levels of the luciferase reporter gene ±s

表3 熒光素酶報告基因相對表達水平Tab.3 Relative expression levels of the luciferase reporter gene ±s

組別miR-NC組miR-106b-5p mimic組t值P值USP32 WT 1.0 ± 0.17 0.33 ± 0.03 7.47 0.001 USP32 MUT 1.0 ± 0.10 1.04 ± 0.11 2.05 0.102

表4 qPCR 測定USP32 和PKM2 mRNA 的表達Tab.4 Expression of USP32 and PKM2 mRNA as determined by qPCR ±s

表4 qPCR 測定USP32 和PKM2 mRNA 的表達Tab.4 Expression of USP32 and PKM2 mRNA as determined by qPCR ±s

組別miR-NC組miR-106b-5p mimic組t值P值USP32 1.0 ± 0.08 0.25 ± 0.04 16.71 0.001 PKM2 1.0 ± 0.06 2.23 ± 0.15 24.36 0.001

圖2 miR-106b-5p 與USP32 的序列互作分析Fig.2 Sequence interaction analysis of miR-106b-5p and USP32

2.3 hPASMCs 中過表達/敲低miR-106b-5p 改變hPAECs 的Warburg 效應 對hPASMCs 進行過表達/敲低miR-106b-5p 處理后，與hPAECs 共培養，隨后通過Western blot 法測定上述hPAECs 胞內Warburg-相關蛋白因子的表達情況，發現與miRNC 組相比，miR-106b-5p mimic 組hPAECs 胞內PKM2、GLUT1、HK2 和LDHA 的相對表達水平均明顯升高；而與Inhibitor-NC 組相比，miR-106b-5p inhibitor 組hPAECs 胞內PKM2、GLUT1、HK2 和LDHA 的相對表達水平均明顯降低（表5）。

表5 hPAECs 胞內Warburg-相關蛋白因子PKM2、GLUT1、HK2、LDHA 的表達水平Tab.5 Expression levels of Warburg-related protein factors PKM2，GLUT1，HK2，and LDHA in hPAECs±s

表5 hPAECs 胞內Warburg-相關蛋白因子PKM2、GLUT1、HK2、LDHA 的表達水平Tab.5 Expression levels of Warburg-related protein factors PKM2，GLUT1，HK2，and LDHA in hPAECs±s

注：與miR-NC組比較，***P ＜ 0.001；與Inhibitor-NC組比較，###P ＜ 0.001

組別miR-NC組miR-106b-5p mimic組t值P值Inhibitor-NC組miR-106b-5p inhibitor組t值P值LDHA 1.00 ± 0.10 2.09 ± 0.14***18.43 0.001 1.11 ± 0.06 0.18 ± 0.02###33.36 0.001 PKM2 1.00 ± 0.11 2.28 ± 0.21***15.52 0.001 1.12 ± 0.07 0.22 ± 0.04###15.23 0.001 GLUT1 1.00 ± 0.07 2.40 ± 0.13***10.42 0.001 1.05 ± 0.08 0.45 ± 0.03###16.69 0.001 HK2 1.00 ± 0.14 1.95 ± 0.09***10.86 0.001 0.94 ± 0.10 0.51 ± 0.04###22.25 0.001

2.4 敲低/過表達PKM2 改變hPAECs 的Warburg 效應 Western blot 法測定Warburg 效應相關蛋白質因子的相對表達水平，在hPAECs 內敲低/過表達PKM2 后，與shRNA-NT 組相比，PKM2 shRNA 組胞內PKM2、GLUT1、HK2 和LDHA 的相對表達水平明顯降低；與vector 組相比，PKM2-OE組胞內PKM2、GLUT1、HK2 和LDHA 的相對表達水平明顯增強（表6）。

表6 Western blot 法測定上述胞內Warburg-相關蛋白因子PKM2、GLUT1、HK2、LDHA 的表達水平Tab.6 Expression levels of Warburg-related protein factors PKM2，GLUT1，HK2，and LDHA as determined by Western blot analysis±s

表6 Western blot 法測定上述胞內Warburg-相關蛋白因子PKM2、GLUT1、HK2、LDHA 的表達水平Tab.6 Expression levels of Warburg-related protein factors PKM2，GLUT1，HK2，and LDHA as determined by Western blot analysis±s

注：與shRNA-NT組比較，*P ＜ 0.05，與shRNA-NT組比較，***P ＜ 0.001；與vector組比較，##P ＜ 0.01，與vector組比較，###P ＜ 0.001

組別shRNA-NT組PKM2 shRNA組t值P值vector組PKM2-OE組t值P值LDHA 1.00 ± 0.15 0.44 ± 0.03*3.756 0.02 1.11 ± 0.07 2.47 ± 0.16###11.88 0.001 PKM2 1.00 ± 0.13 0.27 ± 0.03***13.79 0.001 1.06 ± 0.15 2.78 ± 0.24##7.107 0.002 GLUT1 1.00 ± 0.10 0.51 ± 0.04***5.66 0.005 0.97 ± 0.11 2.26 ± 0.17##6.35 0.003 HK2 1.00 ± 0.18 0.23 ± 0.01***9.85 0.001 1.08 ± 0.09 1.88 ± 0.13###16.58 0.001

3 討論

PAH 血管重塑過程中，hPAECs 和hPASMCs 均表現出不同形式的類癌表型轉化，包括高增殖和抗凋亡以及上皮-間質轉化和纖維化等［12］。且二者在其各自的類癌表型轉化過程中會通過外泌體進行胞間通訊和協同促進彼此的惡性進展［13］。為了發現在這種胞間通訊中起著核心調控作用的關鍵分子，本研究對HC 組和PAH 組外周血漿中的外泌體內含有的miRNAs 進行了微陣列測定和差異表達分析。在顯著上調的miRNAs 列表里miR-106b-5p 位居第3 位。由于miR-106b-5p 與多種癌癥的惡性表型和較差的預后密切相關［14-15］。且本研究對hPAECs 和hPASMCs 給予缺氧誘導處理后，miR-106b-5p 在hPASMCs 的外泌體中上調，而在hPAECs 的外泌體中無變化。隨后對miR-106b-5p 的下游mRNAs 表達調控靶點進行了生物信息學分析，發現miR-106b-5p 能夠與USP32（ubiquitin specific peptidase 32，泛素特異性肽酶32）的3′-UTR 區結合并充當“海綿體”并與PKM2（Pyruvate Kinase M2，丙酮酸激酶M2）表達上調呈正相關。進一步的結果顯示，在hPASMCs 中過表達/敲低miR-106b-5p，將通過抑制/上調PKM2 的表達，改變hPAECs 的Warburg 效應。

泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome system，UPS）負責蛋白酶體降解，調節蛋白質的半衰期。先前針對其生物學功能的研究主要集中于其在促進乳腺癌和胃癌惡性進展和化療藥物耐藥方面的關鍵作用［16］。在該研究中發現，hPASMCs通過外泌miR-106b-5p 負調節hPAECs 胞內USP32 促進PKM2的穩定，并增強hPAECs的Warburg效應。

丙酮酸激酶是Warburg 效應的限速酶，在腫瘤細胞中，這一過程由PKM2的表達上調介導調控［11］。PKM2 的二聚體可轉運至細胞核，與HIF-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，缺氧誘導因子-1α 亞基）相互作用，調節許多Warburg 效應相關酶的表達［11，17］。早期炎癥刺激可激活血管內皮細胞代謝方向轉向Warburg效應，并發出“偽缺氧”信號，穩定HIF-1α［18-19］。然后，大量穩定的HIF-1α進入核內進一步正向調節其他HIF-依賴性Warburg效應相關酶基因的表達。在該研究結果中也顯示，敲低/過表達PKM2能夠改變hPAECs的Warburg效應。

因此，在該研究結果中miR-106b-5p在hPASMCs與hPAECs 的胞間通訊中通過充當USP32 的“海綿體”，調控hPAECs 的代謝重編程。這是一項重要的發現。篩選獲得的標志物miR-106b-5p，可通過后續更大規模PAH 患者血樣分析加以驗證。該研究為以miR-106b-5p 為靶標，開發PAH 治療性分子靶向藥物，奠定了一定的前期研究基礎，積累了臨床前研究資料。

盡管在該研究中，未對miR-106b-5p 作為PAH標志物的臨床價值開展更大規模的驗證研究，這是本次研究的局限。但目前基于該研究結果可知，hPASMCs 通過外泌體上調miR-106b-5p 增強hPAECs 胞內Warburg 效應和細胞增殖，在動脈型肺動脈高壓中具有潛在的促進疾病進展的作用。

【Authors contributions】MAIMAITI Ailifeire conducted all the experiments，processed statistical analysis of data and wrote the manuscript.GAO Jing participated in the experiments partially and reviewed the data independently.YU Zixiang reviewed the data and the manuscript independently.MA Yitong designed the research program，reviewed all of the data and the manuscript.All authors read and approved the final manuscript as submitted.