TMEM39A在原發性膽汁性膽管炎中的作用機制

孫曉彤 韓崇旭， 王嬋 任傳利 張明明

1揚州大學醫學院（江蘇揚州 225009）；2揚州大學臨床醫學院，江蘇省蘇北人民醫院醫學檢驗科（江蘇揚州 225009）；3東南大學生命科學與技術學院發育基因與人類疾病重點實驗室（南京 210096）

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是由先天和后天免疫同時介導，并由單核細胞浸潤膽管細胞，破壞小葉間膽管，導致膽汁淤積，使膽管細胞長時間處于膽汁淤積環境，從而致膽管細胞變性和壞死的疾病［1-3］。PBC 在男女之間的患病率具有差異性，患者多為中老年婦女，男女比例為10∶1［4］。PBC 目前尚無最優的治療方法。目前治療PBC 的藥物首選是熊去氧膽酸，若熊去氧膽酸治療效果甚微，就可用二線藥物奧貝膽酸進行治療［5-6］，但無治愈作用。若患者合并其他疾病，無法選擇肝移植手術，還可進行人工肝支持系統和血漿置換治療［7］。因此研究其發病機制尋找新的治療方法具有重要的社會意義。

PBC 是起源于膽管的炎癥。由于膽汁分泌及排泄障礙可導致膽汁淤積，而肝臟長期處于膽汁淤積狀態可導致肝臟的纖維化和肝硬化。膽汁酸（bile acids，BAs）是膽汁的主要成分，對膽管細胞具有細胞毒性作用。在膽汁淤積狀態下，膽管細胞長期暴露在具有細胞毒性的膽汁酸中，血清膽汁酸水平繼而升高。疏水性膽汁酸甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDC）是膽汁淤積性肝病患者血清中主要的膽汁酸，因此大多數研究都采用GCDC 來誘導細胞凋亡作為研究模型。

TMEM39A 是TMEM 家族中的一員，其蛋白序列由488 個氨基酸和8 個跨膜螺旋片段組成［8］。現已發現TMEM39A 的分子功能與自噬相關［9］，遺傳學研究［10］表明，TMEM39A 基因與原發性膽汁性膽管炎相關。又有研究進一步對PBC 患者和其他自身免疫性疾病分析發現，TMEM39A 在PBC 患者的血液中高表達，并顯著高于其他自身免疫性疾病（系統性紅斑狼瘡和橋本氏病）和健康對照組體內表達，并且TMEM39A 濃度越高，其肝功能越差，預后越差。且已有研究［11］報道稱，在早期和晚期PBC 受損的膽管中自噬相關蛋白即微管相關蛋白3β（LC3）的表達增高。這表明TMEM39A 水平異常在PBC 發病機制中扮演著重要作用。本研究擬模擬PBC 膽管細胞模型，對TMEM39A 在PBC 中的作用機制做初步探索，旨在為PBC 的靶向治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞系培養 人肝膽管癌細胞（RBE），由東南大學劉向東教授饋贈，細胞用10%FBS RPMI-1640 培養基培養，放在5%CO2、37 ℃及飽和濕度的恒溫培養箱培養。

1.2 試劑 RPMI-1640 培養基、胎牛血清購自北京全式金生物，BCA 蛋白定量試劑盒、質粒小提試劑盒、細胞計數試劑盒（CCK-8）購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Hoechst 染色試劑盒、結晶紫染色液購自上海碧云天生物科技有限公司，兔抗人TMEM39A 多克隆抗體購自Abnova 公司，兔抗人LC3 多克隆抗體購自Proteintech 公司，GCDC、4%多聚甲醛購自Sigma-Aldrich 公司，RNA 轉染試劑RNA Fit 購自漢恒生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞活力檢測 使用細胞計數試劑盒（CCK-8）檢測細胞活力。將RBE細胞以每孔2 × 103個細胞接種于96 孔板中。設置control 組、GCDC（500 μmol/L 和1 000 μmol/L）組，三組處理同時培養24、48、72 h 和96 h。培養至第6 天，將新的培養基（不含GCDC）90 μL 和10 μL CCK-8 加入到孔中，在培養箱中避光孵育2 h，使用酶標儀（Biotek）在450 nm 處讀吸光值。

1.3.2 細胞克隆形成實驗 使用結晶紫染色液染色觀察細胞克隆形成。將RBE細胞以每孔1 000個細胞接種于6 孔板中，設置PBS 組和GCDC 組，每天觀察細胞生長狀態，每三天更換一次培養基，培養10 d。使用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色液染色觀察。

1.3.3 細胞劃痕實驗 提前在6 孔板背面劃線，將RBE 細胞以每孔2 × 106個細胞接種于6 孔板中，設置PBS 組和GCDC 組，培養24 h 后，加入含有PBS 和不同濃度的GCDC 的培養基，用細胞微孔成像系統（Biotek）拍照，計為0 h，24 h 后再拍照，計為24 h。比較0、24 h 劃痕愈合程度。

1.3.4 Hoechst 染色實驗 使用Hoechst 染色觀察RBE 細胞凋亡。RBE 細胞以1 × 105個細胞/孔接種于12 孔板中，培養24 h 后，加入含有PBS 和不同濃度的GCDC 的培養基，繼續培養24 h 后，使用Hoechst 染色，在倒置顯微鏡下觀察細胞凋亡。

1.3.5 構建TMEM39A 過表達載體 通過設計合成的TMEM39A 引物，上游引物（TCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGCCCGGTGGAAGGAGG），下游引物（TTATCTAGATCCGGTGGATCCGTTTGCCTTGAGTTCATAACTGTTG）擴增TMEM39A 基因。將質粒pEGFP-C1 和TMEM39A 經過雙酶切、同源重組、轉化進大腸桿菌，在含有Kan 抗性的LB 固體平板上挑取單克隆，擴大培養12 ～ 16 h，提取重組pEGFPC1-TMEM39A 質粒，并經雙酶切和測序驗證重組質粒。

1.3.6 合成siRNA 及陰性對照 將TMEM39A 基因（Gene ID： 55254）提交至漢恒生物公司，由其設計和合成3 對siRNA，同時合成了一對通用陰性對照（Negative Control siRNA，si-NC），將siRNA 轉染到RBE 細胞48 h。

1.3.7 蛋白免疫印跡實驗 重組pEGFP-C1-TMEM-39A質粒和si-TMEM39A及si-NC轉染進原發性膽汁性膽管炎的模型（用1 000 μmol/L GCDC 處理24 h的RBE 細胞）中48 h 后，用1 × PBS 洗滌1 ～ 2 次，每孔加入50 μL 的細胞裂解液，置于冰上20 min，每隔5 min渦旋10 s，低溫離心機離心12 000 r/min，15 min，吸取上清，利用BCA 蛋白定量試劑盒定量，加入適量的5 × SDS loading 蛋白上樣緩沖液。用12%的SDS-PAGE 的分離膠進行電泳（條件：80 V，30 min；120 V，60 min），電泳結束后，將蛋白電轉至PVDF 膜上（條件：260 mA，60 min），用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，再用1% BSA 將TMEM39A 抗體和LC3 抗體分別稀釋500 和2 000 倍后于室溫下孵育2 h，TBST 清洗PVDF 膜4 次，每次5 min，再以抗兔IgG 二抗（1∶10 000）于室溫下孵育1 h，用TBST清洗PVDF 膜6 次，每次5 min，使用適量的高敏型ECL 發光液，使用生物分子成像儀曝光，利用Image J 軟件進行灰度值分析。

1.3.8 實時熒光定量PCR 使用Trizol 試劑提取RBE 細胞中的總RNA，通過HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒逆轉錄合成cDNA，Actin 作為內參，每個樣品設置3 個重復孔，引物由南京金斯瑞和生工生物工程（上海）股份有限公司合成，數據處理根據2-ΔΔCt為目標基因在實驗組和對照組的差異倍數。

1.3.9 統計學方法 所有實驗均重復3 次以上，使用GraphPad Prism7.0 軟件進行統計學分析，數據均以均數±標準差表示。兩組組間數據比較采用非配對t檢驗，P＜ 0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TMEM39A 在原發性膽汁性膽管炎中的發現及其表達 本課題組前期協助完成對2 069 例漢族PBC 樣品和6 163 例對照樣品的GWAS 掃描和驗證試驗，證實TMEM39A（rs3732421）位點達到了GWAS顯著性，見圖1A。（rs3732421數據庫原定位于CD80，現已更正為TMEM39A，見https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/search/all/？term=rs3732421）。通過本課題組前期研究，發現通過酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測PBC 患者和健康對照組的血液標本中的TMEM39A 外周血濃度。發現PBC 組中的TMEM39A 的濃度要高于對照組，見圖1B，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖1 在原發性膽汁性膽管炎中發現了TMEM39AFig.1 The TMEM39A gene has been identified in primary biliary cholangitis.

2.2 GCDC 對RBE 細胞活力的影響 為了研究GCDC 對RBE 細胞活力的影響，利用不同濃度的GCDC（500、1 000 μmol/L）處理RBE 細胞，處理時間為24、48、72、96 h。結果表明，隨著GCDC 處理時間的延長，細胞活力逐漸降低，且GCDC 濃度升高，細胞活力降低，見圖2。差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖2 GCDC 對RBE 細胞細胞活力的影響Fig.2 Effect of GCDC on cell viability of RBE cells

2.3 GCDC對RBE細胞增殖的影響 利用細胞克隆和細胞劃痕檢測GCDC 對RBE 細胞增殖的影響，分別用PBS 和GCDC（500、1 000 μmol/L）處理RBE細胞。結果顯示，GCDC濃度越高，GCDC 對RBE 細胞的抑制作用越明顯，細胞克隆數越少，見圖3A。細胞劃痕實驗顯示，GCDC 濃度越高，細胞愈合率下降，1 000 μmol/L 的GCDC 處理的RBE 細胞愈合率降低最顯著，見圖3B。差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖3 不同濃度的GCDC 對RBE 細胞細胞克隆形成和愈合的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GCDC on cell clonal formation and healing in RBE cells

2.4 GCDC 對RBE 細胞凋亡的影響 Hoechst 染色觀察細胞凋亡，結果顯示，在GCDC 濃度為1 000μmol/L 時，細胞凋亡指數最高，見圖4。差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖4 不同濃度的GCDC 誘導RBE 細胞發生細胞凋亡Fig.4 Different concentrations of GCDC induced apoptosis in RBE cells

2.5 成功構建TMEM39A 過表達載體 為研究TMEM39A 在原發性膽汁性膽管炎中如何調節自噬，通過PCR成功擴增出TMEM39A全基因組序列，并與pEGFP-C1 質粒構建融合表達質粒pEGFPC1-TMEM39A，并將重組質粒成功轉化和提取，通過雙酶切驗證和測序驗證重組成功，見圖5A，并通過實時熒光定量PCR 確定重組質粒轉染時間為48 h，見圖5B。差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖5 基因TMEM39A 過表達載體的構建Fig.5 Construction of overexpression vector of gene TMEM39A

2.6 干擾片段的篩選 由公司合成的3對TMEM39 A 干擾片段和1 對陰性對照，將siRNA 轉染至RBE細胞中，通過Western blot 和實時熒光定量PCR，篩選到1 對siRNA 的敲降趨勢更明顯，見圖6。差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖6 轉染干擾片段后TMEM39A 的表達量Fig.6 The expression of TMEM39A after transfection of interference fragment

2.7 TMEM39A 對原發性膽汁性膽管炎中自噬蛋白表達的影響 在體外根據前文所述實驗結果，1 000 μmol/L GCDC 濃度處理RBE 細胞，其凋亡指數更高；同時使用1 000 μmol/L GCDC 濃度作用細胞后，觀察細胞增殖率最佳時間為24 h。所以在體外利用1 000 μmol/L 的GCDC 濃度來處理細胞24 h，構建原發性膽汁性膽管炎模型，轉染TMEM39A 過表達載體和TMEM39A 干擾片段，檢測自噬蛋白LC3 的蛋白表達水平。結果表明，過表達TMEM39A 會促進自噬蛋白LC3 的蛋白表達量，敲降TMEM39A 會降低自噬蛋白LC3的蛋白表達量，見圖7，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

圖7 TMEM39A 對原發性膽汁性膽管炎中自噬蛋白表達的影響Fig.7 Effect of TMEM39A on autophagy protein expression in primary biliary cholangitis

3 討論

PBC 是由免疫介導的膽汁淤積性疾病，會進行性破壞膽管上皮細胞，最終導致肝硬化和肝衰竭，其臨床癥狀多為乏力、瘙癢等，隱匿性強［12］。遺傳易感性被認為是PBC發展的主要因素之一［13］。原發性膽汁性膽管炎是膽管細胞浸潤在膽汁酸中，膽汁酸對膽管細胞具有細胞毒性作用。膽汁酸的合成是由膽固醇通過經典和替代途徑進行的，并且由肝細胞分泌膽汁酸合成所需要的所有酶［14］，而人體主要的膽汁酸包括膽酸和鵝去氧膽酸，初級鵝去氧膽酸和膽酸是在肝臟中通過多級酶的作用完成的［15-16］。而現在大多數PBC 的研究是基于膽管細胞浸潤在膽汁酸中，其中經常使用的膽汁酸，即是甘氨鵝脫氧膽酸鈉（GCDC），它是膽汁中的主要膽鹽成分。在本研究中，即是選用GCDC 來處理膽管細胞，用于模擬原發性膽汁性膽管炎中的膽管上皮細胞在膽汁淤積的情況。通過不同的實驗方法來檢測不同GCDC 濃度和處理人膽管細胞的最佳時間。最后選擇了GCDC 濃度為1 000 μmol/L 和處理時間為24 h 來作為后續處理細胞的條件。已有研究［17］發現，血清中的膽汁酸濃度在體內一般不會直接引起細胞毒性作用。相比之下，1 000 μmol/L 的GCDC 濃度存在廣泛的細胞毒性作用，代表了體內的膽道水平。膽汁酸的積累會使肝損傷，從而引發一系列的其他的全身癥狀，膽汁酸流量減少會引起膽汁淤積患者的自噬［18］。

自噬是可以降解潛在毒性的細胞結構的保守的分解代謝過程［19］，自噬的失調會導致嚴重的人體病理［18］。現在越來越多的證明表明，自噬的失調參與了PBC 的發病機制。參與慢性非化膿性破壞性膽管炎（CNSDC）的受損膽管細胞顯示自噬標志物LC3 和p62/SQSTM1 的積累。LC3 在PBC 受損的膽管細胞中具有特征性表達［20］，并且自噬體的增加是由于自噬受損所致。有研究表明，GCDC 會導致膽管細胞發生自噬引起自噬失調，而發生自噬的原因尚不明確，但自噬在生理上可控制內質網動力學，從而可能引起內質網應激，并且在研究中表明在PBC 的膽管細胞中可見到內質網應激標記物PDI 和GRP78 的廣泛性表達［21］。

TMEM39A 是跨膜蛋白家族的蛋白，它的編碼序列具有保守型，它的單核苷酸多態性與主要人類疾病相關［22］。有全基因組關聯研究確定了TMEM39A中的單核苷酸多態性（SNPs）與原發性膽汁性膽管炎（PBC）的風險增加相關［10］。TMEM39A定位于內質網上，且它的的分子功能與自噬相關［9］。在本次研究中，構建了TMEM39A 過表達載體和TMEM39A干擾片段，利用RBE細胞作為研究對象，通過轉染TMEM39A 過表達載體和干擾片段，觀察到在RBE 細胞中，TMEM39A 過表達會促進自噬蛋白LC3 的表達。隨后，又用GCDC 處理RBE 細胞，模擬膽汁淤積，再轉染TMEM39A 過表達載體和干擾片段，發現在膽汁淤積的環境下，TMEM39A仍會促進自噬蛋白LC3 的表達。但是，本研究仍存在很多局限性，因實驗條件的限制，未能在在原代膽管上皮細胞中，進行以上一系列實驗的研究。

綜上所述，疏水性膽汁酸GCDC 會誘導人膽管細胞凋亡，模擬膽汁淤積。TMEM39A 的表達增高引起膽管細胞自噬增強使膽管受損，可能是引起PBC 的機制之一。

【Author contributions】SUN Xiaotong performed the experiments and wrote the article.WANG Chan，ZHANG Mingming and SUN Xiaotong designed the study.HAN Chongxu and REN Chuanli reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.