LncRNA NEAT1調(diào)控NF-κB信號(hào)通路對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)的影響

許云春 于馨雅 王雅芝 申元英 郭樂(lè)

大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（云南大理 671000）

代謝相關(guān)脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）是以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度蓄積、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激為特征的一種常見(jiàn)的肝臟疾病［1］，并可發(fā)展為更加嚴(yán)重的肝硬化甚至肝癌等終末期肝病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［2］。MAFLD 受多重因素影響，脂毒性肝損傷和炎癥反應(yīng)是其發(fā)病機(jī)制中最為重要的驅(qū)動(dòng)因素［3］，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑在受損的肝細(xì)胞中被激活并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子分泌，加速疾病進(jìn)展［4-5］，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活可能成為減輕MAFLD 中肝細(xì)胞炎癥損傷的關(guān)鍵［6-7］。因此，探索通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路來(lái)影響肝損傷和炎癥的潛在機(jī)制有望成為新的治療靶點(diǎn)。目前，已有多項(xiàng)研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在炎癥反應(yīng)、免疫功能、物質(zhì)代謝和癌癥等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能［8］，lncRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)度＞ 200 個(gè)核苷酸且不具備蛋白編碼功能的RNA 分子，它能作為促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的信號(hào)或抑制轉(zhuǎn)錄的誘餌、表觀(guān)遺傳調(diào)節(jié)因子等參與基因調(diào)控［9-10］，還可以履行分子介質(zhì)的職責(zé)，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)，影響疾病發(fā)展［11-12］。位于11 號(hào)染色體的核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄本1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）是核lncRNA 的一種類(lèi)型，與趨化因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子產(chǎn)生和炎癥小體激活等炎癥反應(yīng)過(guò)程有關(guān)，還可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子激活NF-κB 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，該通路被激活促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加劇細(xì)胞損傷［13］。有研究［14］表明沉默lncRNA NEAT1 通過(guò)抑制TLR2/NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷和炎癥。然而，lncRNA NEAT1 是否可以通過(guò)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路來(lái)影響MAFLD 中肝細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)目前尚不明確，因此，探究其可能存在的調(diào)控機(jī)制可為MAFLD 的診治提供新見(jiàn)解。本研究以棕櫚酸處理人正常肝永生化細(xì)胞株（LO2）建立MAFLD體外細(xì)胞模型，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)過(guò)表達(dá)或者沉默lncRNA NEAT1，探討其表達(dá)水平變化對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)的影響，并初步闡明其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；0.25%胰酶、青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；20%無(wú)脂肪酸牛血清白蛋白、組織細(xì)胞甘油三酯（TG）酶法測(cè)定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；棕櫚酸（西安鯤創(chuàng)科技有限公司）；油紅O 染料（上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；第一鏈cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及通用型實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；lnRcute lncRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、lnRcute lncRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT / GPT）測(cè)試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST / GOT）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、GAPDH 單克隆抗體（Cell Signaling Technology 公司）；過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNANEAT1（武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司）；小干擾RNA si-NEAT1（genepharma 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、模型建立及分組 使用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)LO2細(xì)胞，并將其置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80% ～ 90%時(shí)，消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為Blank 組（空白對(duì)照），Vehicle組（溶劑對(duì)照），PA 組（模型組：添加0.32 mmol/L 棕櫚酸處理24 h）。設(shè)置Control 組（陰性對(duì)照組）、PA組（模型組）、pcDNA-NC+PA 組（過(guò)表達(dá)空載對(duì)照組）、pcDNA-NEAT1+PA 組（過(guò)表達(dá)組）、si-NC+PA組（沉默陰性對(duì)照組）、si-NEAT1+PA 組（沉默組）。

1.2.2 油紅O 染色和甘油三酯（TG）含量測(cè)定評(píng)估細(xì)胞脂質(zhì)積累 油紅O 染色按照以下步驟進(jìn)行，細(xì)胞處理后，4%多聚甲醛固定30 min，60%異丙醇潤(rùn)洗后使用油紅O 工作液避光染色30 min，60%異丙醇洗滌后蘇木素染液染色2 min，顯微鏡觀(guān)察獲取圖像。TG 含量測(cè)定根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為550 nm 處的吸光度值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算TG 濃度，再通過(guò)BCA 法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白濃度，以蛋白濃度校正TG 含量。

1.2.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2 細(xì)胞接種于96 孔板中，分組處理后，每孔加入CCK8 溶液10 μL，37℃避光孵育1 h 后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450，細(xì)胞活力=［（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）/（OD對(duì)照組-OD空白組）］×100%。

1.2.4 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）酶活力測(cè)定反映肝細(xì)胞損傷 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，波長(zhǎng)510 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值，以絕對(duì)OD值（OD測(cè)定孔-OD對(duì)照孔）查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得相應(yīng)的ALT 和AST 活力單位。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)各目的基因mRNA 水平 采用Trizol 法提取各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)qPCR 檢測(cè)基因表達(dá)變化。采用比較閾值循環(huán)法（2-△△Ct）計(jì)算各目的基因的相對(duì)mRNA 表達(dá)量，其中以GAPDH 的表達(dá)作為內(nèi)參，主要基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)炎癥因子蛋白分泌水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照各指標(biāo)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，即刻測(cè)量OD450值，并根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出相應(yīng)的濃度。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡（WB）和免疫熒光（IF）檢測(cè)NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡按以下步驟進(jìn)行，細(xì)胞處理后加入RIPA 裂解液提取總蛋白，使用BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定并定量，選取12.5%SDS-PAGE 凝膠進(jìn)行電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉或5%BSA封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗于室溫孵育1 h，最后經(jīng)ECL 曝光成像。免疫熒光檢測(cè)NFκB p65 核轉(zhuǎn)位情況，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.5% Triton X-100 作用2 min 使細(xì)胞膜通透，1%BSA 封閉2 h，加入NF-κB p65 抗體4 ℃孵育過(guò)夜，次日室溫避光孵育熒光二抗，并用DAPI 染核，最后使用熒光顯微鏡觀(guān)察獲取圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 棕櫚酸處理對(duì)LO2 細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)的影響 與Blank 組相比，Vehicle 組溶劑處理對(duì)LO2細(xì)胞脂質(zhì)積累、細(xì)胞活力、細(xì)胞損傷、炎癥因子表達(dá)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；而PA 組棕櫚酸處理后LO2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)明顯積累，細(xì)胞活力降低，肝細(xì)胞損傷指標(biāo)ALT、AST 酶活性增高，炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)升高（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 棕櫚酸處理對(duì)LO2 細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of palmitic acid treatment on LO2 cell injury and inflammatory response

2.2 棕櫚酸處理對(duì)LO2 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)水平的影響 與Blank 組相比，Vehicle 組溶劑對(duì)照處理對(duì)lncRNA NEAT1表達(dá)無(wú)影響（P＞ 0.05），PA 組棕櫚酸處理后lncRNA NEAT1 表達(dá)增高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 棕櫚酸處理對(duì)LO2 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NEAT1 表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of palmitic acid treatment on the expression level of lncRNA NEAT1 in LO2 cells

2.3 過(guò)表達(dá)及沉默lncRNA NEAT1 轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè) 結(jié)果顯示，與過(guò)表達(dá)空載對(duì)照組（pcDNANC+PA）相比，過(guò)表達(dá)組（pcDNA-NEAT1+PA）lncRNA NEAT1 表達(dá)水平進(jìn)一步增高，與沉默陰性對(duì)照組（si-NC+PA）相比，沉默組（si-NEAT1+PA）lncRNA NEAT1 表達(dá)降低，提示過(guò)表達(dá)及沉默均成功（P＜ 0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)及沉默lncRNA NEAT1 轉(zhuǎn)染效果的檢測(cè)Fig.3 Detection of overexpression and inhibition effects after interference with lncRNA NEAT1

2.4 過(guò)表達(dá)及沉默lncRNA NEAT1 對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)的影響 結(jié)果顯示，與過(guò)表達(dá)空載對(duì)照組（pcDNA-NC+PA）相比，過(guò)表達(dá)組（pcDNA-NEAT1+PA）細(xì)胞活力顯著降低，肝損傷指標(biāo)ALT、AST 和炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)進(jìn)一步增高；與沉默陰性對(duì)照組（si-NC+PA）相比，沉默組（si-NEAT1+PA）細(xì)胞活力有所恢復(fù)，肝損傷指標(biāo)、炎癥因子水平均下調(diào)（P＜ 0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)及沉默NEAT1 對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)的影響Fig.4 Effects of overexpression and inhibition of NEAT1 on palmitic acid induced L02 cell injury and inflammatory response

2.5 過(guò)表達(dá)及沉默lncRNA NEAT1 對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路的影響 與Control組相比，PA 組棕櫚酸處理后NF-κB 信號(hào)通路被激活，NF-κB 抑制蛋白IKBα 降解，NF-κB p65 的磷酸化及核轉(zhuǎn)位增加。與過(guò)表達(dá)空載對(duì)照組（pcDNANC+PA）相比，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1后進(jìn)一步促進(jìn)二者變化。與沉默陰性對(duì)照組（si-NC+PA）相比，沉默lncRNA NEAT1 則提高了IKBα 的表達(dá)并減少NF-κB p65的磷酸化及核轉(zhuǎn)位，見(jiàn)圖5。

圖5 過(guò)表達(dá)及沉默lncRNA NEAT1 對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of overexpression and inhibition of lncRNA NEAT1 on NF-κB signaling pathway in palmitic acid-induced LO2 cells

3 討論

在MAFLD 中，肝臟脂質(zhì)沉積過(guò)多導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，在長(zhǎng)期慢性的脂毒性刺激下，肝細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激性損傷，肝臟表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，伴隨氧化應(yīng)激增強(qiáng)，炎癥介質(zhì)增加，肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重［15-16］。因此，探究能夠改善肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)等病理生理過(guò)程的策略對(duì)緩解MAFLD 的發(fā)展尤為重要。越來(lái)越多的lncRNA 被發(fā)現(xiàn)在疾病過(guò)程中異常表達(dá)，它們已被廣泛建議作為某些病理環(huán)境中的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)臨床診斷及療效判定等方面具有重要價(jià)值。LncRNA NEAT1作為其中的一種，被證實(shí)與多種肝臟疾病的發(fā)病以及病情進(jìn)展有關(guān)，它能夠加速肝纖維化和肝細(xì)胞癌的進(jìn)展，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)在急慢性肝衰竭的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮保護(hù)作用［17］。然而，在MAFLD 中l(wèi)ncRNA NEAT1 是否發(fā)揮調(diào)節(jié)肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)的作用尚未被闡明。因此，本文就上述問(wèn)題進(jìn)行分析。

對(duì)于該病的研究，使用棕櫚酸處理HepG2、LO2 細(xì)胞構(gòu)建體外細(xì)胞模型已被充分報(bào)道與證實(shí)［18-20］。其中，油紅O 染色和甘油三酯含量測(cè)定是反映肝細(xì)胞脂質(zhì)積累的常用方法，也是用于指示建模成功的關(guān)鍵指標(biāo)；ALT、AST 則是反映肝細(xì)胞損傷和判斷損傷程度的酶；TNF-α、IL-1β、IL-6 作為經(jīng)典的炎癥細(xì)胞因子，其表達(dá)增加與肝臟炎癥狀態(tài)相關(guān)。本研究采用棕櫚酸誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞建模，與預(yù)期結(jié)果一致，處理后細(xì)胞脂質(zhì)沉積，甘油三酯含量增加，還存在肝細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，說(shuō)明MAFLD 細(xì)胞模型構(gòu)建成功。在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)lncRNA NEAT1 在棕櫚酸誘導(dǎo)后的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)，且與肝細(xì)胞損傷和炎癥因子表達(dá)呈正相關(guān)，提示lncRNA NEAT1 可能是棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的重要調(diào)控分子。進(jìn)一步過(guò)表達(dá)或沉默lncRNA NEAT1 對(duì)其進(jìn)行功能研究，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)該分子加劇棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，沉默該分子后可以緩解上述損傷，以上結(jié)果表明，lncRNA NEAT1 在棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致MAFLD 疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一，NF-κB 信號(hào)通路的激活在其中發(fā)揮重要作用，靜息狀態(tài)下NF-κB 由p65 和p50 與其抑制蛋白（inhibition of NF-κB，IκB）結(jié)合形成三聚體以無(wú)活性形式存在于肝細(xì)胞胞漿中，受到刺激時(shí)IκB 被降解，釋放出的NF-κB p65 亞基在胞質(zhì)中被激活，然后磷酸化移位進(jìn)入胞核誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6 等多種促炎基因的表達(dá)［21］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中，NF-κB 抑制蛋白IκBα 被降解，釋放出的NF-κB p65 磷酸化入核增多，提示脂毒性損傷狀態(tài)下，NF-κB 炎癥信號(hào)通路被激活。推測(cè)NF-κB 信號(hào)通路的激活和異常表達(dá)的lncRNA NEAT1 可能存在聯(lián)系，具體調(diào)控關(guān)系尚不明確。先前的研究［22］表明lncRNA NEAT1 通過(guò)正調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)化膿性小鼠的腦損傷和細(xì)胞凋亡與炎癥；lncRNA NEAT1/miR-193a-3p通過(guò)影響TLR4/NF-κB 信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和炎癥損傷［23］；抑制NEAT1 的表達(dá)通過(guò)減少NF-κB p65 的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位來(lái)保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷［24］，這些都為闡明lncRNA NEAT1 能夠調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路提供了有力依據(jù)。本研究同樣證明，過(guò)表達(dá)lncRNA NEAT1 可以進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB 信號(hào)通路的激活，加劇肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，沉默lncRNA NEAT1可以減少該通路的激活，下調(diào)肝細(xì)胞損傷指標(biāo)和炎癥因子。以上結(jié)果證實(shí)，沉默lncRNA NEAT1 可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)減輕肝細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)，從而在MAFLD 中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了lncRNA NEAT1與棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，且首次驗(yàn)證了沉默lncRNA NEAT1 通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)改善上述損傷。但本研究?jī)H在體外細(xì)胞模型中得到驗(yàn)證，并且lncRNA NEAT1 調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路還可能是通過(guò)海綿化下游靶miRNA 來(lái)發(fā)揮作用，本課題組下一步將深入研究lncRNA NEAT1 的具體調(diào)控機(jī)制并在動(dòng)物模型中補(bǔ)充論證，以期為代謝相關(guān)脂肪性肝病的診治提供更為可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【Author contributions】XU Yunchun performed the experiments and wrote the article.YU Xinya，WANG Yazhi performed the experiments.SHEN Yuanying and GUO Le designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.