結腸類器官培養(yǎng)體系的構建研究進展

陳嘉琪 史秀麗 黃雪云 吳娜

1江西中醫(yī)藥大學（南昌 330004）；2江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院（南昌 330006）

炎癥性腸病是（inflammatory bowel disease，IBD）一種常見的結腸疾病，其發(fā)病機制仍未完全闡明，現(xiàn)多認為其是多因素的，包括宿主遺傳因素、免疫失調、微生物植物群、環(huán)境因素和上皮屏障缺陷［1］。其中免疫調節(jié)的重點是修復黏膜愈合缺陷，但上皮因子屏障的形成機制還不清楚，腸上皮細胞在腸屏障和免疫調節(jié)功能中起重要作用，腸上皮穩(wěn)態(tài)和再生對闡明疾病發(fā)病機制及改善治療方法具有重要意義。2009 年，SATO 等［2］第一次成功培育出腸道類器官，這使人們對腸干細胞和黏膜再生的認識不斷加深。類器官（organoids）是指一種三維（3D）細胞培養(yǎng)物，體外培養(yǎng)的organoids 能夠再現(xiàn)原始器官的結構和功能特征［3-4］。結腸類器官（colon organoids）的培養(yǎng)來源為富含亮氨酸重復序列G 蛋白偶聯(lián)受體5 陽性（leucine-rich repeatcontaining G-protein coupled receptor 5，LGR5+）成體干細胞和多能干細胞（Pluripotent stem cell，PSC）［5］。結腸類器官的培養(yǎng)條件為添加了優(yōu)化生長因子WENR（Wnt3A、EGF、Noggin、R-spondin 1）的培養(yǎng)基［6-8］。本文就結腸類器官的培養(yǎng)體系進行綜述，旨在為結腸類器官相關科研工作者提供參考。

1 結腸類器官培養(yǎng)源

多數(shù)研究者［6-12］使用6 ～ 8 周、190 ～ 220 g 的C57BL/6 雄性鼠作為結腸類器官的培養(yǎng)源，該實驗鼠為近交系小鼠，近交系基因純合，遺傳穩(wěn)定，表型一致，背景資料清晰可查［13］，且C57BL/6 小鼠具有各種腫瘤發(fā)病率低、補體活性高、干擾素產(chǎn)量高和易于繁殖等優(yōu)點［14-15］。也有研究者使用兔［16］（歐洲兔、“新西蘭白”實驗兔、澳大利亞野生兔）、禽類［17］、豬［18］、人類［6，9］等的結腸干細胞作為colon organoids 培養(yǎng)源。

2 結腸類器官基礎培養(yǎng)基的制備

腸上皮是一種獨特的單層結構，小腸上皮包括隱窩和絨毛，而在結腸中不存在絨毛［20］。隱窩是充滿未分化細胞的內陷結構，其頂部具有吸收電解質和水的功能，在其底部，LGR5+干細胞與潘氏細胞（Paneth cell）交錯排列［21］。LGR5+干細胞分裂增殖產(chǎn)生過渡增殖細胞（transit amplifying cell，TA 細胞），TA 細胞生長分化形成腸功能細胞，包括腸上皮吸收細胞（Alp+）、Paneth 細胞（Lyz+）、杯狀細胞（Muc2+）、內分泌細胞（Chga+）等。Paneth 細胞可以表達EGF（表皮細胞生長因子）、Wnt-3a（人重組Wnt-3a 蛋白）、TGF-α（α 轉化生長因子）和Dll4（Dll4 重組蛋白），這些因子可以促進干細胞的增殖分化。然而，值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)結腸組織中不存在Paneth 細胞，但其所具有c-Kit 陽性分泌細胞與Paneth 細胞功能相似，在結腸類器官培養(yǎng)基中添加外源性Wnt-3a 與c-Kit 陽性分泌細胞協(xié)作以替代單一Paneth 細胞的作用是必須的。

結腸類器官的培養(yǎng)條件為添加了WERN（Wnt-3a、EGF、R-spondin 1、Noggin）的無血清培養(yǎng)基，其中Wnt-3a 可以維持干細胞的自我更新及分化能力，Wnt-3a 通過刺激Wnt 信號傳導以達到隱窩增殖的目的［2，22-24］；EGF 信號主要刺激小腸Lgr5+和TA細胞的增殖；R-spondin1 是Wnt 激動劑，同時也是Lgr5+的配體，Lgr5+與配體 R-spondin1 結合可增強Wnt-β-catenin 信號通路，通過Paneth 細胞放大Wnt 通路的局部效應而起作用，Wnt 通路可以刺激隱窩基底柱狀細胞（crypt base columnar cell，CBC）的增殖，在體內可以導致隱窩大量增殖［25-26］；BMP信號（bone morphogenetic protein，骨形態(tài)發(fā)生蛋白）在腸道發(fā)育過程中主要誘導異位隱窩的形成，當缺失BMP通路抑制劑如Noggin時，BMP信號持續(xù)誘導上皮細胞建立異位隱窩，最終會導致息肉和腫瘤的發(fā)生，另外，BMP信號會與Wnt信號發(fā)生拮抗作用，從而阻礙Lgr5+的增殖，因此，在培養(yǎng)基中添加Noggin（BMP 通路抑制劑）的轉基因表達可以維持類器官中正常隱窩的擴增［27-28］。通常來說，由于動物血清含有不確定的分化因子，因此無血清培養(yǎng)基更適合干細胞的培養(yǎng)，但是無血清培養(yǎng)基需要補充其他因子，如FGF、礦物質和維生素等［9，11］。

3 結腸類器官擴增培養(yǎng)基的制備

分離結腸隱窩后，將其與必需的生態(tài)位因子（即WERN）一起包埋在Matrigel 中，并形成稱為類器官的定型結構，然后通過添加各種分子抑制劑以及生長因子等以促進隱窩的增殖。在培養(yǎng)后1 個月開始，結腸類器官的形態(tài)從出芽結構變?yōu)槟倚越Y構，在形態(tài)學轉變的同時，細胞增殖逐漸減少，在此時期ALK 受體和P38 信號負調控腸上皮細胞的增殖，因此加入A83-01（ALK4/5/7 抑制劑）和SB202190（P38 抑制劑）可以抑制類器官的死亡，顯著提高類器官形成率［6，19］，但FUJII 等［29］指出，用胰島素樣生長因子1（IGF-1）和成纖維細胞生長因子2（FGF-2）替代p38 抑制劑，能夠在保持細胞多樣性的同時有效培養(yǎng)人腸類器官。“B-27 Supplement”是一種優(yōu)化的無血清添加劑，可以擴增來自小鼠EGF 響應性的前體細胞。“N2-Supplement”可以促進原代細胞培養(yǎng)中有絲分裂后期神經(jīng)元的生長和表達。“Penicillin-Streptomycin Liquid”青鏈霉素雙抗溶液，作為培養(yǎng)基的一部分用于細胞培養(yǎng)，可有效抑制多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的生長，從而有效控制細胞被細菌污染。成纖維細胞生長因子（bFGF）能夠刺激細胞的增殖，高水平的FGF4 和Wnt-3a 協(xié)同作用能夠促進腸內胚層和腸管狀形態(tài)的生成，從而形成3D 腸球樣體，進一步培養(yǎng)形成3D 腸組織［30］。HIBIYA 等［7］研究者還添加了肝細胞生長因子（HGF），HGF 能作用于上皮細胞、造血細胞等多種細胞，可調節(jié)細胞生長、運動和形態(tài)發(fā)生。YIN 等［31］研究者發(fā)現(xiàn)CHIR99021［糖原合成酶3β（GSK3β）抑制劑］和VPA［乙酰化酶（HDAC）抑制劑］能夠刺激干細胞的自我更新，其菌落形成效率是ENR 條件下的20 ～ 50 倍，且CV 條件下培養(yǎng)的細胞可作為單細胞傳代10 倍以上，其菌落形態(tài)、繁殖能力、集落形成效率和干細胞潛能與新分離的Lgr5+干細胞相似。另外，NEUROG3（腸內分泌癥中突變的促內分泌應答因子）是體外培養(yǎng)的人腸內分泌細胞所必須的［32-33］。在人類結腸隱窩的培養(yǎng)基中，除了需要添加WENR 等基本生長因子外，還需要添加一些激素和維生素類物質，如加入胃泌素（gastrin）和煙酰胺（nicotinamide）可以提高培養(yǎng)效率，延長類器官的存活時間且不干擾腸分化［6］；在培養(yǎng)結直腸癌（colorectal cancer，CRC）類器官時需制定適合腫瘤類器官培養(yǎng)的選擇性培養(yǎng)基［34］，在腫瘤組織中某些信號通路異常激活，因此可以去除特定的生長因子，比如，在Wnt 信號特異性激活的腸癌類器官的培養(yǎng)基中，需要去除Wnt 和R-spondin1；存在EGFR 通路突變的CRC 中，去除EGF；存在p38突變的CRC 中，則去除p38 抑制劑SB202190［35］；由于癌細胞對氧濃度敏感，可以在低氧情況下培養(yǎng)晚期CRC 類器官。值得注意的是，有研究者發(fā)現(xiàn)Paneth 細胞體內外的自我更新和增殖依賴于LGR5+干細胞與Paneth 之間的直接物理接觸，因此Paneth 細胞和Lgr5+干細胞的共培養(yǎng)可以提高結腸類器官的培養(yǎng)效率［31，36］，Lgr5+干細胞的增殖依賴于Notch 通路，Notch 通路也依賴于細胞之間的直接接觸。見表1。

表1 結腸類器官培養(yǎng)基中添加的生長因子Tab.1 Growth factors added in colonic organoid medium

4 結腸類器官分化培養(yǎng)基的制備

Lgr5+干細胞每24 小時分裂1次并分化為各種腸上皮細胞，分化后的主要泌系細胞包括分泌激素的內分泌細胞，產(chǎn)生黏液的杯狀細胞和隱窩中的潘氏細胞。在Lgr5+干細胞分化前，可向結腸類器官增殖培養(yǎng)基中加入或移除特定分子抑制劑及生長因子以促進結腸類器官定向分化。結腸類器官的培養(yǎng)在WERN 條件下，Lgr5+干細胞增殖，但是其中Wnt-3a 會干擾腸道的分化并產(chǎn)生主要由未分化祖細胞組成的類器官，煙酰胺和p38 抑制劑SB202190 也在很大程度上抑制吞咽細胞和腸道內分泌的分化［32，37］，因此，在結腸類器官組織的分化期應當去除這兩種試劑以產(chǎn)生成熟的吞咽細胞和內分泌細胞。Lgr5+干細胞受Wnt、Notch、BMP和EGF 等各種信號的影響［38］，其中，Wnt 和Notch是控制腸道干細胞分化的兩個主要信號通路，當這兩種信號通路均開放時，Lgr5+干細胞維持增殖狀態(tài)。IWP-2 是Wnt 通路抑制劑，DAPT 是Notch抑制劑。在WERN 條件下，DAPT 通過Notch 通路轉錄因子CSL 的條件性靶向耗竭腸道干細胞，以終止腸道上皮增殖，并誘導分泌性細胞的分化，IWP-2 誘導腸細胞和Paneth 細胞的分化，IWP-2 和DAPT 同時應用則誘導Lgr5+向杯狀細胞的分化。CHIR 和VPA 的組合促進多種組織中上皮干細胞的增殖，而不是分化。VPA 抑制分泌細胞系的分化。IWP-2 和VPA 的組合特異性地誘導了腸細胞分化，可能的機制是，IWP-2 誘導了腸細胞分化，而VPA 抑制了Lgr5+干細胞向分泌細胞類型分化。同樣，DAPT 和CHIR 的組合主要誘導Paneth 細胞分化，而IWP-2 和DAPT 的組合主要誘導杯狀細胞分化［3，31］。結腸隱窩細胞在培養(yǎng)第10-12 天開始出現(xiàn)具有中央腔的單層上皮細胞和表現(xiàn)出出芽隱窩的結腸球，當中央腔中出現(xiàn)黑色陰影即凋亡的上皮細胞，則可以進行傳代處理。

5 結腸類器官模型的檢測

結腸類器官的形態(tài)結構可由HE（蘇木精-伊紅）、IHC（免疫組織化學染色）、AB（Alcian blue）染色，WB（Western blot）分析檢測。HE 染色可以見到出芽后的結腸類器官中內腔的上皮和間質充結構域，在健康的結腸黏膜中有著簡單且整齊的柱狀上皮，內有中央腔結構。同樣，IHC 染色后能夠在結腸類器官組織中見到β-catenin（β-連環(huán)蛋白）的膜、細胞質和細胞核強烈表達，腸道發(fā)育以及維持上皮完整性有賴于β-catenin 和E-cadherin（上皮細胞鈣黏蛋白）之間的緊密結合［39］，而Wnt 通路的激活也與此緊密相關，β-catenin 的強表達表明結腸類器官具有高度的蛋白質穩(wěn)定性。同時還可以見到散在分布的Mucin 2，Mucin 2 對腸黏膜起保護作用的。AB 能夠將酸性蛋白聚糖染為藍色，可以在結腸類器官中觀察到少量杯狀細胞和由杯狀細胞分泌的酸性、中性黏蛋白，這兩種黏蛋白構成黏液層以保護結腸上皮屏障，免受細菌和炎性細胞的浸潤。緊密連接蛋白在一定程度上控制腸道的通透性，通過WB 分析可以在成功建立的結腸類器官模型中見到參與緊密連接的蛋白（Ocln、Tjp1、Cldn4 和Cldn8）均呈陽性［40］。

結腸類器官的增殖活性可由IHC、PAS（Periodic Acid-Schiff stain）染色，免疫熒光和流式細胞術分析等檢測。其中PAS 染色可見到分化成熟的杯狀細胞；增殖標記物KI67（一種增殖細胞的相關抗原）的IHC 染色，能夠見到結腸柱狀上皮中的細胞均勻增殖。在2017 年，MUNERA 等［41］研究者明確了SATB2 是人類小腸（回腸）和結腸上皮的典型標志物，IHC 染色能夠觀察到結腸類器官上皮組織中SATB2 的表達。PAS 染色能夠顯示結腸上皮組織中CDX2 均勻且強烈的表達，CDX2 能夠平衡結腸組織的增殖與分化，還可以促進上皮屏障和腸球體（SPH）的形成［19］。免疫熒光和流式細胞術分析能夠顯示結腸組織中關鍵再生相關標記物（SCA1、ANXA1、REG3b 和CLU）的表達［3］。

結腸類器官的功能性屏障特性可通過以下幾種試驗來測定：在結腸類器官出現(xiàn)出芽形態(tài)后，通過occludin 染色可突出顯示上皮細胞鵝卵石組織，向培養(yǎng)基中添加的熒光葡聚糖4 kDa 顯示缺乏通過腸屏障均可驗證結腸類器官的腸屏障功能［42］；毛猴素腫脹試驗亦可以測試結腸類器官的腸屏障功能以及生存力，在類器官中加入毛喉素以誘導膨脹，當隨著水流入量的增加，類器官的大小也隨之增加時即表明此類器官是富有生命力的；MTT比色法可以測定腸上皮細胞的存活率以鑒定結腸類器官的細胞活力。

6 結腸類器官的應用

HAHN 等［11］在2017 年首次建立了一種基于結腸類器官的上皮間質轉化（OEMT）模型，這是一種新型的腸纖維化模型，該模型為研究具有抗纖維化活性的藥物帶來了可靠的體外模型，也為開發(fā)基于人器官的腸纖維化模型搭建了橋梁；同年，潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）的小鼠結腸類器官模型由HIBIYA 等［7］成功建立，該研究首次證實了用特定試劑誘導的長期炎癥刺激引起的結腸類器官的細胞轉化，對該體外模型的繼續(xù)研究為建立炎癥相關的癌變提供了基礎，人類患者來源的UC 類器官模型則由SARVESTANI 等［19］以及ALDEBERT 等［19］于2021 年分別建立，其中SARVESTANI 等［19］建立的模型以患者特異性的方式識別和理解腸上皮細胞和基質細胞直接相互作用背后的潛在機制，解決了上皮類器官僅關注上皮，而不包括結腸炎中微環(huán)境的作用的問題，具有研究人類UC 的上皮-間充質和腸道微環(huán)境相互作用的優(yōu)勢；LI 等［43］在2019 年使用新生小鼠第9 天的結腸成功培育出新生兒腸上皮類器官，并將器官暴露于低氧和脂多糖（LPS）48 h 誘導了上皮損傷，這為研究新生兒期腸道生理、病理學以及新生兒期疾病過程［如壞死性結腸炎（NEC）］提供了離體平臺；據(jù)現(xiàn)有報道的小鼠和人結腸上皮細胞長期培養(yǎng)方案，可適用于原發(fā)性結腸腺瘤或腺癌以及Barrett 食管，這也將是癌類病生物學和藥物開發(fā)的研究不可或缺的基石。

7 結語

以上總結了結腸類器官的培養(yǎng)體系，但目前針對結腸類器官培養(yǎng)的研究仍較少，還需要大量的有效實驗重現(xiàn)來驗證結腸類器官的培養(yǎng)體系。2014 年，Hans Clever 實驗室發(fā)表了小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)的方法和步驟，但對于結腸類器官體外培養(yǎng)條件和方法的描述仍比較籠統(tǒng)。此外，值得注意的是，小鼠與人類CXCL8（一種炎性趨化因子）沒有同源性，因此該軸在遺傳或化學誘導的小鼠模型中不存在，所以在研究UC 等炎癥性腸病的腸道類器官時，應使用人類患者結腸干細胞衍生的UC 模型［19］。然而，IBD 患者來源的類器官是否保留了新鮮活檢樣本中發(fā)現(xiàn)的疾病特征尚未得到證實，這也為進一步研究留下了空間。此外，大多數(shù)類器官培養(yǎng)物時使用的基質膠是最常用的細胞外基質，用于支持干細胞培養(yǎng)，但細胞外基質是一種定義不清的異質性蛋白質混合物，這增加了培養(yǎng)類器官時未考慮的未知變量，可能會影響它們準確再現(xiàn)體內生理學的能力［6］。

雖然結腸類器官目前還存在一定的局限性，有待科研工作者進一步的優(yōu)化，但是它擁有廣闊的應用前景，相信隨著干細胞技術的發(fā)展，結腸類器官能夠達到以替換或修復患者的缺陷腸組織為主要目標的再生醫(yī)學應用，并且為結腸疾病開發(fā)以腸上皮功能恢復和組織再生為目標的治療方法研究提供可靠的臨床前研究模型。

【Author contributions】CHEN Jiaqi collected the literature and wrote the article.SHI Xiuli and HUANG Xueyun assisted in the collection of literature.WU Na revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.