丹參飲片、水煎液、配方顆粒的HPLC指紋圖譜相關性研究

王壽富 黎桃敏 張?zhí)m蘭 鐘志奎 施文婷 劉權(quán)震 魏 梅

廣東一方制藥有限公司廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東佛山 528244

丹參主產(chǎn)地為河北、陜西、山東等，其基源是唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBge.），取其干燥根和根莖入藥，其味苦，性微寒，可具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛等，常用于胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉等病癥[1-2]。丹參是我國常用的大宗藥材，其發(fā)揮主要藥效的關鍵成分為丹參所富含水溶性的酚酸類以及脂溶性的丹參酮類化合物，對血液及心血管系統(tǒng)有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、抑制心肌纖維化等作用[2-5]。

2021年發(fā)布的《關于結(jié)束中藥配方顆粒試點工作的公告》（2021年第22號）明確將中藥配方顆粒的質(zhì)量監(jiān)管納入中藥飲片管理范疇，凸顯了中藥飲片的主體性，也表明在臨床應用上中藥配方顆粒是中藥飲片的補充[6]。本研究利用HPLC法測定丹參飲片、水煎液、配方顆粒的指紋圖譜[7]，對丹參飲片到水煎液再到配方顆粒制備全過程的質(zhì)量相關性進行探究，以期為丹參配方顆粒的生產(chǎn)全過程質(zhì)量控制和生產(chǎn)試驗提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

試驗用儀器見表1。

表1 試驗所用儀器明細

1.2 試藥

試驗用試藥見表2，其中17批丹參藥材均為正品，可供本試驗研究使用，藥材鑒定員為廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師；對應的飲片（編號Y1～Y17）、水煎液（編號S1～S17）和配方顆粒（編號K1～K17）均按照相關要求規(guī)定的方法制備而來。

表2 試驗所用試藥明細

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[8]

采用Waters Xselect HSS T3色譜柱（柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5.0 μm）；采用雙相流動相系統(tǒng)按表3進行梯度洗脫；體積流量為1.0 ml/min；檢測波長為286 nm，進樣量為10 μl。

表3 梯度洗脫表

2.2 標準品溶液的制備[8]

精密稱取各對照品適量，加入甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）制成含丹參素19.992 μg/ml、原兒茶醛18.426 μg/ml、咖啡酸18.943 μg/ml、丹酚酸E 21.462 μg/ml、迷迭香酸21.288 μg/ml、紫草酸143.374 μg/ml和丹酚酸B 103.169 μg/ml的混合標準品溶液。

2.3 供試液的制備

2.3.1 丹參飲片供試液[8]取丹參飲片進行粉碎處理，粉末過三號篩，取過篩后粉末約0.2 g，精密稱定，加甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率為140 W、頻率為42 kHz）30 min，取出，靜置至樣品冷卻至室溫，再次稱定重量，用甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）補足減失的重量，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得丹參飲片供試液。

2.3.2 丹參水煎液供試液[8]精密吸取丹參水煎液10 ml，再加甲醇溶液40 ml，照“2.3.1”項下制備方法，自“密塞，稱定重量”起，同法制備，即得水煎液供試液。

2.3.3 丹參配方顆粒供試液[8]取丹參配方顆粒約0.2 g，研細，精密稱定，按照“2.3.1”項下制備方法，自“加甲醇水溶液（甲醇體積占比為80%）50 ml”起，同法制備，即得配方顆粒供試液。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗[9]取空白溶劑、混合標準品溶液及樣品供試液適量，依法測定，記錄譜圖，見圖1。在相應的保留時間處，樣品供試液與混合標準品溶液色譜均被洗脫出相同的色譜峰，且空白溶劑對各成分的出峰無干擾，表明該方法具有良好的專屬性。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜堆疊圖

2.4.2 精密度試驗[10]取“2.2”項下混合標準品溶液連續(xù)進樣6次，依法測定，計算得各特征峰峰面積的RSD值均＜3%，表明試驗所用儀器具有良好的精密度。

2.4.3 重復性試驗[11]按“2.3”項下方法，取同一份配方顆粒制備6份樣品供試液，依法測定，計算得各特征峰峰面積的RSD值均＜3%，表明該方法具有良好的重復性。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗[12]按“2.3”項下方法制備丹參配方顆粒供試液，分別在得到樣品供試液的第0、2、4、8、12、24 h依法測定，計算得各特征峰峰面積的RSD值均＜3%，表明樣品供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定可測。

2.5 HPLC指紋圖譜的確立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜的確立[13]中藥指紋圖譜所包含的化學信息更加全面，更能準確反映中藥內(nèi)在質(zhì)量[14]。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）和Origin 2018軟件，將采集到的丹參飲片、丹參水煎液及丹參配方顆粒的指紋圖譜進行疊加，形成共有模式，并建立對照指紋圖譜R1、R2、R3，見圖2～4。17批丹參飲片、水煎液及配方顆粒的指紋圖譜均標記出8個共有特征峰，通過與對照品圖譜比對，確定1號峰為丹參素、2號峰為原兒茶醛、3號峰為咖啡酸、4號峰為丹酚酸E、5號峰為迷迭香酸、6號峰為紫草酸、7號峰為丹酚酸B。

圖2 17批丹參飲片的HPLC指紋圖譜

圖3 17批丹參水煎液的HPLC指紋圖譜

圖4 17批丹參配方顆粒的HPLC指紋圖譜

2.5.2 相似度評價[13]采用多點校正法和Mark峰匹配，分別計算各批次飲片、水煎液、配方顆粒HPLC指紋圖譜與其對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果見表4，17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜與其對照指紋圖譜的相似度及丹參飲片-水煎液、飲片-配方顆粒、水煎液-配方顆粒間的相似度均大于0.990，表明不同批次丹參飲片、水煎液、配方顆粒的化學成分較為一致、質(zhì)量較為穩(wěn)定，丹參飲片到水煎液再到配方顆粒的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，主要化學成分無丟失。

表4 丹參飲片、水煎液及其配方顆粒HPLC指紋圖譜相似度評價結(jié)果

2.6 化學模式識別

化學模式識別作為一種統(tǒng)計分析手段，是化學計量學的重要組成部分，可以將原始數(shù)據(jù)集中差異性信息提取并分類[15-17]，如聚類分析法、主成分分析法、偏最小二乘法等是化學模式識別中較為常見的集中分析方法，在中藥指紋圖譜數(shù)據(jù)分析中得到了較為廣泛的應用[15-16]。

2.6.1 Pearson相關性分析[7]以17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒共51個樣品“各特征峰峰面積與特征峰總面積的比值”為變量，通過SPSS 20.0軟件進行Pearson相關分析，結(jié)果詳見表5。丹參飲片與水煎液相比較，有4個共有特征峰呈現(xiàn)極顯著的正相關性；丹參飲片與配方顆粒相比較，有4個共有特征峰呈現(xiàn)極顯著的正相關性，1個共有特征峰呈顯著正相關性；丹參水煎液與配方顆粒比較，8個共有峰均具有極顯著的正相關性，說明丹參配方顆粒與水煎液之間可以進行較穩(wěn)定的質(zhì)量傳遞。

表5 丹參HPLC指紋圖譜共有峰的相關性分析結(jié)果（r值）

2.6.2 聚類分析[18]以8個共有特征峰的“各特征峰峰面積與特征峰總面積的比值”為變量，利用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒進行聚類分析，結(jié)果見圖5，當平方Euclidean距離為15時，除Y4外，其余飲片單獨聚為一類，水煎液和配方顆粒另聚為一類，說明配方顆粒與水煎液質(zhì)量較為一致。

圖5 丹參HPLC指紋圖譜聚類分析（CA）樹狀圖

2.6.3 主成分分析[18]以“各特征峰峰面積與特征峰總面積的比值”值為變量，利用SPSS 20.0軟件，對17批飲片、水煎液、配方顆粒的8個共有特征峰進行主成分分析，結(jié)果見表6、7及圖6。以特征值＞1為提取標準[19]，提取出前2個主成分，其總方差的累積貢獻率達89.33%，表明提取的2個主成分基本能反映全部指標的信息，其中主成分1載荷高的成分對飲片、水煎液和配方顆粒質(zhì)量的影響最大。由主成分得分圖可以看出水煎液與配方顆粒質(zhì)量更為接近，這與聚類分析結(jié)果一致。

圖6 丹參HPLC指紋圖譜主成分得分圖

表6 丹參HPLC指紋圖譜主成分分析結(jié)果

表7 丹參HPLC指紋圖譜主成分因子載荷矩陣

2.6.4 偏最小二乘法（PLS）分析[20-21]PLS分析是一種多元數(shù)據(jù)分析方法，在中藥指紋圖譜研究領域得到了廣泛應用[20-21]。為進一步篩選影響分類的標志物，以17批丹參飲片、水煎液、配方顆粒的分類作為因變量（Y），8個共有峰峰面積占比作為自變量（X）；采用軟件SIMCA 14.1軟件進行PLS回歸分析。由表8可知該模型預測能力較好。根據(jù)圖7可知，前6個色譜峰的VIP貢獻值＞1，說明丹酚酸E、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和峰8對于飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜分類具有重要作用，而紫草酸及迷迭香酸的影響作用相對較小。

圖7 丹參HPLC指紋圖譜分類影響因素VIP得分圖

表8 丹參HPLC指紋圖譜分類的PLS回歸精度分析

3 討論

本研究通過HPLC法建立了丹參飲片、水煎液及配方顆粒的指紋圖譜，并結(jié)合化學模式識別對丹參飲片、水煎液、配方顆粒指紋圖譜信息進行了對比分析。相似度評價結(jié)果顯示，飲片、水煎液、配方顆粒對照指紋圖譜間的相似度均大于0.990，表明三者的化學成分基本一致，其主要成分可進行穩(wěn)定傳遞。Pearson相關分析、聚類分析、主成分分析均顯示水煎液與配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量更為接近，這與“中藥配方顆粒與其相對應的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致”的要求相符合[22-23]。PLS回歸分析結(jié)果表明，影響指紋圖譜信息分類的標志性成分主要是丹酚酸E、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸B和峰8，以上確認的5種化學成分均為水溶性的丹酚酸類化合物，可發(fā)揮涼血消癰、清心除煩的功效[24-25]，對丹參配方顆粒質(zhì)量控制有重要作用。

綜上，本研究從飲片、水煎液、配方顆粒三者的關聯(lián)性方面進行研究，反映了丹參飲片、水煎液、配方顆粒之間的質(zhì)量相關性，可作為丹參配方顆粒生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制的數(shù)據(jù)參考。