丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化模型大鼠TGF-β/Smad4信號(hào)通路的影響

彭馥芝 徐儀昕 蔣 堃 陳思源 余曦明 張 逢 余望貽

湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，湖南長(zhǎng)沙 410208

肝纖維化是肝臟對(duì)自身免疫性、病毒性、藥物性等多種慢性損傷的病理性修復(fù)反應(yīng)[1-2]。其發(fā)生的中心事件是：在各種慢性損傷因素影響下，肝星狀細(xì)胞被活化，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，與肝臟微環(huán)境中的淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等協(xié)同作用，通過(guò)自分泌等方式共同促進(jìn)肝臟炎癥及纖維化進(jìn)程[3-4]。因此，在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，許多細(xì)胞因子以及細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)通路均能對(duì)其產(chǎn)生影響[5-8]。丹芪護(hù)肝方由丹參、黃芪、女貞子等組成，具有平肝清熱，活血行氣的功效，臨床上用于慢性乙型肝炎和濕熱血瘀兼腎虛者，但尚未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化的影響。本研究通過(guò)制備大鼠肝纖維化動(dòng)物模型，探討丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用。并通過(guò)檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/信號(hào)通路通用調(diào)節(jié)因子4（SMAD family member 4，Smad4）信號(hào)通路變化，初步揭示丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化的可能機(jī)制，以期為臨床診療上丹芪護(hù)肝方的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD（sqrague dawley）大鼠48只，雌雄各半，體重140～160 g（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：430727211100469235），購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]；飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由進(jìn)食及飲水，溫度20～25℃，相對(duì)濕度為55%～65%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)通過(guò)（倫理號(hào)：LL2021031704）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

聯(lián)苯雙酯滴丸（批號(hào)：A02J181131）；四氯化碳（批號(hào)：C11588428）；大豆油（批號(hào)：C17900081）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser，批號(hào)：RR047B）；染料法熒光定量試劑盒（SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ，批號(hào)：RR82LR）；Trizol總RNA提取試劑（批號(hào)：DP424）；平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（批號(hào)：BS-10196R）、TGF-β1（批號(hào)：BS-0086R）、Smad4（批號(hào)：BS-0585R）單克隆抗體；RIPA裂解緩沖液（批號(hào)：JH-23075）；BCA（bicinchoninic acid assay）；蛋白定量試劑盒（批號(hào)：FV-87028354）；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝膠配制試劑盒（批號(hào)：20197701）。

1.3 動(dòng)物造模及給藥

48只SD大鼠被隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組（陽(yáng)性藥物對(duì)照組）、丹芪護(hù)肝方組，每組12只。四氯化碳（CCL4）與大豆油按比例配成40% CCL4混合溶劑后，2次/周，腹腔注射8周，制備大鼠肝纖維化模型。丹芪護(hù)肝方由丹參10 g、黃芪12 g、女貞子10 g、白花蛇舌草30 g、白芍15 g、郁金10 g組成。所有藥材均從湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院統(tǒng)一購(gòu)買(mǎi)，在湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室煎制。將所有藥材放入適量水中進(jìn)行濃煎至200 ml，口服，1 次/d。根據(jù)不同種屬動(dòng)物間用藥劑量換算系數(shù)[9]（參照60 kg成人進(jìn)行等效劑量換算），自造模之日起，聯(lián)苯雙酯組（50 mg/kg）和丹芪護(hù)肝方組（9.14 g/kg）給予相應(yīng)藥物治療，模型組和正常對(duì)照組灌胃等體積的生理鹽水，1 次/d，連續(xù)8周。

1.4 肝臟指數(shù)測(cè)定

末次給藥后禁食24 h，2%的戊巴比妥鈉（2 ml/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉。腹主動(dòng)脈取血后立即摘取肝臟，經(jīng)沖洗、濾紙吸干水分后稱量濕重并計(jì)算肝臟指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器濕重（g）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%。

1.5 肝功能測(cè)定

麻醉后腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h，于4 ℃，3500 r/min，離心15 min后取血清使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，T-BiL）、直接膽紅素（direct bilirubin，D-BiL）。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)肝組織中α-SMA、TGF-β1和Smad4 mRNA表達(dá)

提取各組大鼠肝組織中總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），檢測(cè)RNA完整性和純度后，進(jìn)行RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)；55～95℃熔解30 s。采用2-△△Ct公式計(jì)算α-SMA、TGF-β1及Smad4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.7 蛋白免疫印跡（western blot，WB）檢測(cè)肝組織中α-SMA、TGF-β1和Smad4蛋白表達(dá)

提取各組大鼠肝臟組織蛋白，采用BCA法對(duì)各組蛋白樣品進(jìn)行定量。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜封閉2 h。封閉完成后，用α-SMA（1∶10000）、TGF-β1（1∶1000）、Smad4（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）抗體孵育過(guò)夜。等滲緩沖鹽溶液（TBS with Tween-20，TBST）洗滌以除去殘留的一抗，二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗滌后，放入化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)化學(xué)發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性用單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan法進(jìn)行多重比較。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝臟指數(shù)的影響比較

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和丹芪護(hù)肝方組肝臟指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝臟指數(shù)的影響（ ± s）

表2 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝臟指數(shù)的影響（ ± s）

注 與正常對(duì)照組比較，▲P ＜ 0.05；與模型組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01

組別 n 肝重（g） 肝臟指數(shù)（%）正常對(duì)照組 12 16.94±0.97 3.14±0.41模型組 12 21.42±1.50▲ 5.11±0.49▲聯(lián)苯雙酯組 12 18.86±1.16★★ 4.54±0.58★丹芪護(hù)肝方組 12 19.89±0.65★ 4.39±0.58★

2.2 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝功能的影響比較

模型組大鼠血清中ALT、AST、T-BiL、D-BiL含量與正常對(duì)照組比較，均顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和丹芪護(hù)肝方組大鼠肝功能指標(biāo)ALT、AST、T-BiL、D-BiL含量均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表3。

表3 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響（ ± s）

表3 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝功能的影響（ ± s）

注 ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；T-BiL：總膽紅素；D-BiL：直接膽紅素；與正常對(duì)照組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與模型組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01

組別 n ALT（U/L） AST（U/L） T-BiL（μmol/L） D-BiL（μmol/L）正常對(duì)照組 12 46.18±3.92 27.31±2.23 0.71±0.11 0.78±0.09模型組 12 192.36±7.79▲▲ 83.12±5.26▲▲ 2.77±0.35▲▲ 2.15±0.21▲▲聯(lián)苯雙酯組 12 101.37±5.14★★ 49.94±3.78★★ 2.17±0.21★ 1.97±0.22★丹芪護(hù)肝方組 12 115.66±4.98★★ 53.74±3.37★ 2.16±0.32★ 1.84±0.19★

2.3 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織 α-SMA表達(dá)的影響比較

模型組大鼠肝組織α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較均升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），提示肝星狀細(xì)胞被激活，肝纖維化發(fā)生。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和丹芪護(hù)肝方組大鼠肝組織α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)量均降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織α-SMA表達(dá)的影響

2.4 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β/Smad4信號(hào)通路的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和丹芪護(hù)肝方組大鼠肝組織TGF-β1、Smad4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）；聯(lián)苯雙酯組TGF-β1、Smad4蛋白及mRNA表達(dá)均低于丹芪護(hù)肝方組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 丹芪護(hù)肝方對(duì)肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、Smad4表達(dá)的影響

3 討論

目前中醫(yī)藥治療以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為研究肝纖維化防治的重要方向之一。丹芪護(hù)肝方以丹參、黃芪為疏肝要藥，疏泄肝氣，調(diào)暢氣機(jī)；配伍女貞子、蛇舌草、白芍、郁金，調(diào)和諸藥共為佐使。全方合用具有疏泄氣機(jī)，化瘀活血的作用。

肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是一種肝間質(zhì)細(xì)胞，HSC被激活后能合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，產(chǎn)生膠原酶，成為肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[10-11]。研究表明，當(dāng)α-SMA表達(dá)水平升高時(shí)，HSC被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化模型大鼠的α-SMA表達(dá)顯著上升，而丹芪護(hù)肝方干預(yù)后，α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯下降，提示丹芪護(hù)肝方也能通過(guò)抑制肝星狀細(xì)胞活化來(lái)抑制肝纖維化。

TGF-β是目前公認(rèn)的細(xì)胞分化過(guò)程中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，而TGF-β1是目前研究最多的TGF-β亞型，具有廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)細(xì)胞增生、遷移、分化及凋亡均有重要影響[14]。研究表明，作為重要的促肝纖維化因子之一，TGF-β1能刺激HSC分泌細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白酶抑制劑，增加細(xì)胞外基質(zhì)沉積，促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化，從而引發(fā)肝纖維化[15-18]。因此，TGF-β1水平在肝纖維化時(shí)最高，通過(guò)下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，抑制HSC的活化，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，進(jìn)而延緩肝纖維化的進(jìn)程[19-20]。Smad4是TGF-β1介導(dǎo)纖維化和炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[21]。Smad4的條件性缺失可抑制纖維化和TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原的表達(dá)[22]。研究證實(shí)，肝纖維化過(guò)程中，各類損傷因子會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)TGF-β1表達(dá)大量增加，TGF-β1通過(guò)與靶細(xì)胞表面的TGF-β 受體結(jié)合，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)分子，與Smad4 結(jié)合形成多聚體后轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，被激活的目的基因通過(guò)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量膠原，最終形成肝纖維化[23-25]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，丹芪護(hù)肝方能夠抑制肝纖維化大鼠TGF-β1和Smad4的表達(dá)，提示丹芪護(hù)肝方可能通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad4信號(hào)通路抑制肝纖維化。

綜上所述，丹芪護(hù)肝方能夠通過(guò)抑制TGF-β/Smad4信號(hào)通路，抑制肝星狀細(xì)胞活化，抑制肝纖維化發(fā)揮護(hù)肝作用。