P54/cAMP/PKA信號(hào)調(diào)控在酒精依賴大鼠中的相關(guān)性研究

李 齊 安子宜 董澤嵩 畢鵬翔 李 姝 劉洪鳳 耿艷萌 岳 輝 薛繼婷霍楠楠 朱曉峰▲

1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江 157011；2.開灤總醫(yī)院，河北唐山 063001；3.浙江省麗水市中心醫(yī)院，浙江麗水 323000

酒精依賴是現(xiàn)今最為常見的物質(zhì)依賴疾病之一，患病人數(shù)僅次于尼古丁依賴綜合征的人數(shù)，酒精已經(jīng)成為全球第二大的成癮物質(zhì)，全球大約有4.9%（約2.4億）的人群受到其影響[1-2]。我國(guó)的酒精依賴和濫用問題也在日益增多，而且增加的速度較快[3-4]。酒精依賴已經(jīng)成為現(xiàn)今中國(guó)重大公共衛(wèi)生問題之一，引起了極大的重視[5]。

P54蛋白是一種神經(jīng)特異性蛋白，是一種廣泛分布于大腦及外周組織的小分子神經(jīng)肽[6]。近年來，關(guān)于P54對(duì)神經(jīng)精神行為影響的相關(guān)研究引起了廣泛關(guān)注[7-8]。P54與物質(zhì)依賴的關(guān)系并不明確。Umut等[9]探討了P54與酒精依賴之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然該研究的結(jié)果無法證實(shí)酒精依賴、酒精戒斷與P54水平之間的關(guān)系，但是P54的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制可能參與了酒精依賴或酒精戒斷的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。還有研究發(fā)現(xiàn)[10]，P54可能通過調(diào)控cAMP/PKA信號(hào)通路，參與了物質(zhì)成癮的發(fā)生和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[SCXK（遼）2015-0001]SPF級(jí)SD雄性大鼠共50只，6周齡，體重170～200 g。動(dòng)物模型的構(gòu)建以及后續(xù)檢測(cè)均在牡丹江醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室[SYXK（黑）2019-006]內(nèi)完成。全部SD大鼠的使用以及飼養(yǎng)符合牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例并符合倫理要求。

1.1.2 主要試劑 無水乙醇（深圳邁瑞，18190511G902）；總RNA提取試劑盒（Solarbio，R1200）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，RR037A）；TB Green?Premix Ex TaqTM（Takara，RR420A）；引物（上海生工）；慢病毒試劑（武漢金思拓）。

1.1.3 主要儀器 NanoDrop2000 （Thermo）；C1000TM Thermal Cycler PCR（美國(guó)伯樂）；StepOne Real-Time PCR System（Applied Biosystems）；腦立體定位儀（上海玉妍）；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（泰盟公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型組建立 SD大鼠單籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)表法分成五組：對(duì)照組（control組）、10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型組（10% ethanol組）、慢病毒陰性對(duì)照組（JL-control組）、慢病毒空載組（JL-NC組）和P54過表達(dá)組（JL-P54組），每組各10只。開始建模喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中飲食正常，飲水則是每個(gè)籠內(nèi)放置兩個(gè)飲水瓶。control組兩個(gè)水瓶均是蒸餾水，其余組兩個(gè)水瓶分別是10%酒精溶液和蒸餾水，建模期間，每天早上8∶00分別測(cè)量飲水量（ml/24 h）和飲酒量（ml/24 h），并記錄。為了避免形成位置偏愛，每天必須要交替更換酒瓶和水瓶的位置。持續(xù)造模4周（28 d）。每周更換墊料，檢測(cè)體重。測(cè)定酒精偏好后，control組和10% ethanol組麻醉后斷頭處死。取出雙側(cè)海馬組織，稱重后存放于-80℃冰箱中。

1.2.2 酒精偏好的測(cè)定[7]構(gòu)建模型成功后，計(jì)算模型組的酒精偏好，主要是掌握SD大鼠每天消耗的酒精量占了總液體（酒精+蒸餾水）的消耗量百分比，酒精偏好（%）=酒精總消耗量（ml）/（酒精+水）總消耗量（ml）×100%。

1.2.3 P54過表達(dá)組的建立與cAMP/PKA信號(hào)通路成分的變化 ①慢病毒提前從-80℃冰箱中取出，置于冰上緩慢融化。②JL-control組、JL-NC組、JL-P54組七氟烷吸入麻醉后，腦立體定位儀在大鼠頭部的右側(cè)半球前囟外側(cè)1.5 mm和骨頭后1.0 mm相交處鉆一個(gè)小孔，微量進(jìn)樣器分別吸取生理鹽水（JL-control組）、陰性對(duì)照試劑（JL-NC組）和慢病毒（JL-P54組）5 μl后，緩慢通過此小孔進(jìn)入右側(cè)腦室，注入后靜止1 min，然后緩慢移除微量進(jìn)樣器，封閉該孔。操作完畢后，將三組大鼠送回籠中，注意保溫，密切觀察狀態(tài)。三組大鼠飼養(yǎng)條件同前。③轉(zhuǎn)染5 d后，麻醉后斷頭處死。取出雙側(cè)海馬組織，稱重后存放于-80℃冰箱中。

1.2.4 Western Blot檢測(cè) 海馬組織稱重后，加入裂解緩沖液（PMSF∶RIPA裂解液=1∶100），研磨裂解，冰上搖床30 min，低溫離心機(jī)4℃，13 000 r/min，離心12 min，取上清液，濃度在20～40 mg/ml。充分混勻后，100℃水浴煮沸10 min，每個(gè)孔道加入蛋白樣品和Marker，每孔上樣量為10 μl（總量10～20 μg），Marker上樣4 μl，80 V電泳50 min，120 V電泳2 h。轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉作為封閉液封閉1 h后，一抗孵育過夜，二抗孵育60 min，洗膜顯色，Imgel J灰度值分析，所測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=所測(cè)目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較選采用單因素方差分析（ANOVA），P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜ 0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制統(tǒng)計(jì)圖運(yùn)用Graphpad Prism 9.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 建模期內(nèi)10% ethanol組的飲酒量、飲水量和酒精偏好情況

10% ethanol組經(jīng)歷了連續(xù)28 d雙瓶自由飲酒，在造模最后7 d，其酒精攝入量（16.80±0.63）ml/24 h保持穩(wěn)定，飲水量（11.90±0.39）ml/24 h保持穩(wěn)定，酒精偏好穩(wěn)定在（57.74±1.83）%，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖1。

圖1 建模期內(nèi)10% ethanol組的飲酒量、飲水量和酒精偏好情況

2.2 P54、AC、PKA、CREB蛋白在酒精依賴SD大鼠海馬組織的表達(dá)情況

與control組比較，10% ethanol組P54、AC、PKA、CREB蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖2。說明酒精依賴大鼠蛋白的表達(dá)變化可能與長(zhǎng)時(shí)間的酒精攝入有關(guān)。

圖2 P54、AC、PKA、CREB蛋白在酒精依賴SD大鼠海馬組織的表達(dá)情況

2.3 P54、AC、PKA、CREB蛋白在三組大鼠海馬組織的表達(dá)情況

JL-P54組P54蛋白的表達(dá)較JL-control組及JL-NC組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），提示JL-P54組造模成功。與JL-control組、JL-NC組比較，JL-P54組P54、AC、PKA蛋白表達(dá)量增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01），CREB蛋白表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；JL-control組、JL-NC組P54、AC、PKA、CREB蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖3。結(jié)果說明，P54可能參與介導(dǎo)酒精依賴大鼠海馬組織內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)通路的調(diào)控。

圖3 P54、AC、PKA、CREB蛋白在三組大鼠海馬組織的表達(dá)情況

3 討論

酒精依賴是當(dāng)前全球范圍內(nèi)物質(zhì)成癮中最為復(fù)雜的一種，它所涉及的問題已經(jīng)嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。酒精依賴是一種比較復(fù)雜的疾病，目前為止，其病因仍不明確，因此對(duì)于成癮機(jī)制的探索有待新的突破，期望其能夠?yàn)榻窈蟮闹委熖峁┬碌乃悸泛途_的靶點(diǎn)。

成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是進(jìn)行科學(xué)研究的第一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟。本研究選用SD大鼠來制備10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型。結(jié)果表明，10%雙瓶自由連續(xù)性飲酒模型組通過28 d連續(xù)性飲酒造模，其酒精攝入量在逐步增多，最后到達(dá)平臺(tái)期，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和Deal等[11-12]構(gòu)建動(dòng)物自由飲酒模型的結(jié)果相類似，即當(dāng)大鼠連續(xù)性攝入酒精的時(shí)候，酒精的消耗開始逐漸增加。

近年來研究發(fā)現(xiàn)酒精調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)功能，特別是長(zhǎng)期練習(xí)飲酒之后導(dǎo)致信號(hào)級(jí)聯(lián)神經(jīng)適應(yīng)性變化，可能是長(zhǎng)時(shí)間飲酒的細(xì)胞內(nèi)分子基礎(chǔ)[13]。根據(jù)研究[14-16]，cAMP/PKA信號(hào)通路參與介導(dǎo)了物質(zhì)成癮（酒精、嗎啡、尼古丁等）相關(guān)的機(jī)制，cAMP/PKA信號(hào)通路的多種組成成分，例如AC、CREB、PKA等均發(fā)生了適應(yīng)性的變化。有學(xué)者研究認(rèn)為，P54在大腦中與動(dòng)機(jī)、情感和強(qiáng)化相關(guān)的區(qū)域（如海馬區(qū)等）表達(dá)量低，可以通過AC降低cAMP水平，抑制神經(jīng)元活動(dòng)[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在酒精依賴SD大鼠的海馬區(qū)組織中，P54、AC、CREB、PKA的表達(dá)水平明顯下降，認(rèn)為其表達(dá)量下降與長(zhǎng)時(shí)間的酒精攝入相關(guān)；當(dāng)P54過表達(dá)時(shí)，AC、PKA、CREB的表達(dá)水平也明顯升高，說明P54可能通過參與調(diào)控cAMP/PKA信號(hào)通路，繼而來參與酒精依賴的發(fā)生。

綜上所述，本研究探討并證明了P54/cAMP/PKA表達(dá)變化與長(zhǎng)期酒精攝入相關(guān)，它可能通過P54參與調(diào)節(jié)cAMP/PKA信號(hào)通路，在酒精依賴發(fā)生過程中起著重要的作用，這一研究為酒精依賴神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的探討提供新的思路。本研究也有缺陷，如未研究P54和cAMP/PKA信號(hào)通路之間是如何調(diào)控的，因此下一步將研究其調(diào)控機(jī)制。