養血補腎方對形覺剝奪性近視豚鼠鞏膜重塑及TGF-β2的作用研究

羅悅，郭曉勤，陳亦霞，曹雯媗，亢澤峰，莊曾淵，楊劍英，吳寧玲

近視是屈光不正的一種形式，表現為視遠模糊、屈光度超過-0.50 D、軸向長度增加等[1]。如今，近視正影響著全球約25 億人的視覺質量[2]。研究[3]認為，鞏膜重塑是高度近視的根本原因之一，而轉化生長因子-β2（transforming growth factor-β，TGFβ2）是鞏膜重塑的關鍵調節因子。本課題組前期研究[4]發現，運用養血補腎方（YangxueBushenFormula，YXBS）可以改善高度近視視網膜的血供，延緩高度近視發展。本研究以形覺剝奪性近視（form-deprived myopia，FDM）豚鼠模型為研究對象，觀察YXBS 對FDM 豚鼠鞏膜膠原及TGF-β2 表達的影響，初步探討YXBS 治療近視、影響鞏膜重塑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2 周齡雄性普通級健康三色豚鼠40 只，體質量180～200 g，購自北京科宇動物養殖中心[許可證號：SCXK（京）2022-0004]，飼養于中國中醫科學院眼科醫院眼功能實驗室，自由進食，室溫20～22 ℃，晝夜循環照明，定期檢查豚鼠眼部健康狀況。本研究實驗動物及實驗所用條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》相關規定。

1.2 藥品、試劑與儀器

1%復方托吡卡胺滴眼液、0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（日本參天制藥有限公司，J20210051、H20210362），鼠抗TGF-β2抗體（上海惠誠生物科技有限公司，GMP-042），磷酸鹽緩沖液（北京優尼康生物科技有限公司，SS1657）。眼科A/B型超聲診斷儀（天津市索維電子科技有限公司，RU-1020CG），偏光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，BX51-P），帶狀檢影鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司，YZ24），自動脫水機、鋪片機、烤片機、切片機（德國Leica 公司，LEICA 300、LEICA 255、HI1220、RM2255）。

YXBS 的組成：枸杞子、菟絲子、五味子、覆盆子、車前子、熟地黃各15 g，白芍、當歸、川芎、丹參、白術各12 g，黃芪20 g，均由中國中醫科學院眼科醫院中藥房提供，加水煎煮并濃縮成濃度為1 g/mL 的藥液使用。

1.3 建立FDM豚鼠模型

正常飼養7 d后，選取40只豚鼠以塑料眼罩（乳白色半透明氣球）遮蓋右眼，以右眼作為模型眼；左眼不做特殊處理，為自身對照眼，建立FDM 豚鼠模型[5]。遮蓋右眼、正常飼養60 d 后，行雙眼檢影驗光、眼軸測量，以造模前后雙眼屈光度和眼軸差異有統計學意義，視為造模成功。

1.4 分組與給藥

將上述造模成功的40 只FDM 模型豚鼠隨機分為YXBS 組和模型組（model group，MG），每組各20 只。YXBS 組豚鼠給予12.70 g/kg YXBS 灌胃，MG組給予灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液，每日1 次，連續15 d。

1.5 屈光度與眼軸檢查

（1）屈光度：于造模前1 d 和造模后第60 天，將豚鼠置于暗室，1%復方托吡卡胺滴眼液散瞳，帶狀檢影鏡檢影驗光，雙眼各1 次。散光以半量等效球鏡度計算屈光度。（2）眼軸：于造模前1 d 和造模后第60 天，在豚鼠雙眼結膜囊內滴入0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液，在室內自然光環境，調整A超增益矯正儀器，應用A/B 超檢測豚鼠眼軸，雙眼各1 次，每次連續測量3次，取平均值。

1.6 HE染色觀察鞏膜形態

灌胃結束后1 d 后取材。豚鼠麻醉處死后，采用75%乙醇對雙眼眼瞼及周圍消毒，標記與角膜中央水平徑線處垂直的鼻側、顳側角膜緣，沿記號剪開球結膜，摘除豚鼠眼球，置于視野操作臺的玻璃皿中。于顯微鏡下用眼科顯微剪剪開角鞏膜緣，依次去除眼前節組織、玻璃體，保留鞏膜組織，放入4%多聚甲醛中固定，24 h后進行石蠟包埋、切片，并行蘇木精—伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE），于顯微鏡下觀察鞏膜組織形態。

1.7 免疫組織化學染色檢測鞏膜TGF-β2表達

將上述制備的切片經浸蠟、脫蠟、洗蠟、抗原修復、封閉后，加鼠抗TGF-β2 抗體（稀釋比例1∶200）孵育過夜。次日洗片后，加入二抗孵育1 h，依次進行顯色、復染、中性樹膠封片后，在光學顯微鏡下觀察，并采用“北航圖像分析系統”測量陽性區灰度值，圖片采集均從視神經切面旁開一個視野開始，在高倍鏡視野下以400 倍拍攝2～3 個圖像，陽性區灰度值越大，則TGF-β2表達水平越高。

1.8 統計學方法

使用SPSS 25.0統計分析，符合正態分布且方差齊的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對樣本t檢驗。當P＜0.05時，認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MG組FDM豚鼠屈光度與眼軸的變化

（1）屈光度：造模前MG 組豚鼠雙眼屈光度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；造模前對照眼屈光度較造模后，差異無統計學意義（P＞0.05）；與造模前比較，造模后模型眼屈光度降低（t=15.960，P=0.000），且低于造模后對照眼（t=14.962，P=0.000），差異有統計學意義。（2）眼軸：造模前MG 組豚鼠雙眼眼軸比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；造模后雙眼眼軸均較造模前延長（t模型眼=21.274，t對照眼=15.844，均P=0.000），且模型眼眼軸長于對照眼（t=5.998，P=0.000），差異均有統計學意義（表1）。

表1 FDM豚鼠屈光度與眼軸的變化（±s，n=20）

表1 FDM豚鼠屈光度與眼軸的變化（±s，n=20）

注：* 與對照眼比較，P＜0.05；# 與造模前比較，P＜0.05；FDM形覺剝奪性近視

眼別模型眼對照眼t值P值屈光度（D）造模前3.52±0.79 3.57±0.72 0.296 0.384造模后-2.88±1.61*#3.12±0.79 0.296 0.384眼軸（mm）造模前7.32±0.18 7.35±0.16 0.557 0.581造模后8.60±0.20*#8.23±0.19#5.998 0.000

2.2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜形態的影響

MG 組豚鼠對照眼鞏膜膠原呈緊密排列狀態，纖維間隙小，纖維束間均勻分布著膠原細胞，膠原細胞胞核數量較多，纖維分布有序，走行規則、結構較均一；MG 組豚鼠模型眼鞏膜厚度明顯縮小，纖維直徑縮小，鞏膜膠原稀疏，走行欠規則，纖維間隙擴大；YXBS 組模型眼鞏膜膠原排列較為緊密，纖維束間均勻分布著膠原細胞，膠原細胞胞核數量較多，纖維走行稍欠規則，纖維間隙稍縮短（圖1）。

圖1 YXBS對FDM豚鼠鞏膜形態的影響（HE染色，×400）

2.4 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達的影響

TGF-β2 陽性染色主要集中在光感受器細胞層，在MG 組模型眼中明顯減弱，在MG 組對照眼、YXBS組模型眼中染色較強（圖2）。2組豚鼠對照眼的TGF-β2 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與對照眼比較，2 組豚鼠模型眼鞏膜TGF-β2表達水平均降低（tYXBS=4.538，tMG=6.981，均P=0.000），且YXBS 組豚鼠模型眼TGF-β2 表達水平高于MG 組模型眼（t=2.154，P=0.049），差異均有統計學意義（表2）。

圖2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達的影響（免疫組織化學染色，×400）

表2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達的影響（±s，n=8）

表2 YXBS對FDM豚鼠鞏膜TGF-β2表達的影響（±s，n=8）

注：* 與對照眼比較，P＜0.05；# 與MG組比較，P＜0.05；FDM 形覺剝奪性近視；TGF-β2 轉化生長因子-β2

組別YXBS組MG組t值P值TGF-β2模型眼109.04±12.12*#95.82±12.43*2.154 0.049對照眼132.20±7.84 133.24±8.68 0.252 0.805

3 討論

研究[6]表明，眼球后極部鞏膜異常擴展、變薄伴鞏膜細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度降解是高度近視不斷發展的關鍵病因之一。實驗研究[7]顯示，眼軸延長與鞏膜重塑直接相關，而鞏膜重塑取決于鞏膜ECM 構成的改變。鞏膜ECM 由鞏膜成纖維細胞合成，膠原是其主要組成成分，鞏膜膠原蛋白的積累與分解，直接影響鞏膜的生物力學，引起眼軸變化[8]。本研究結果顯示，FDM 豚鼠模型眼的平均屈光度、眼軸，在形覺剝奪60 d 后降低，提示單眼FDM豚鼠模型成功建立。

TGF-β2 被認為是鞏膜重塑的關鍵調節因子之一，研究[9-10]發現，高度近視患者鞏膜TGF-β2 的表達水平與眼軸長度具有相關性。TGF-β2 表達的顯著下調，可使成纖維細胞的增生活性降低，ECM 合成分泌減少，纖維鞏膜變薄，鞏膜抵抗力降低，鞏膜易于延伸，從而導致眼軸延長[11]。有研究[12]認為，TGF-β受Wnt/β-連環蛋白信號通路調控，介導鞏膜重塑。在FDM豚鼠的眼睛中，Wnt/β-連環蛋白信號通路被激活[13]，TGF-β2 作為Wnt/β-連環蛋白信號通路的下游因子，可促進ECM 中I 型膠原蛋白的降解，使鞏膜膠原蛋白的積累減少，引起鞏膜重塑[7]；TGF-β2 還參與了信號的跨膜傳遞，由跨膜I 型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體轉導，從而介導細胞與ECM 之間的內部和外部通訊[14]，調節鞏膜重塑。因此，通過調節TGF-β2 調控鞏膜重塑可能是治療近視的有效途徑。

本研究結果顯示，MG 組模型眼鞏膜TGF-β2的表達低于對照眼，YXBS組模型眼鞏膜TGF-β2的表達高于MG 組模型眼。由此可見，FDM 模型的建立下調了豚鼠鞏膜TGF-β2表達，而YXBS可上調鞏膜TGF-β2的表達。

有研究[15]認為，肝腎虧虛、氣血不足是近視進展的基本病機，并總結出莊曾淵教授的經驗方—養血補腎方。本方根據肝腎虧虛、氣血不足的基本病機，由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子、熟地黃、當歸、白芍、川芎、丹參、黃芪、白術組成，臨床療效良好。方中枸杞子補肝腎、益精明目，菟絲子補益肝腎明目，覆盆子益腎、養肝明目，車前子明目，五味子補腎益氣生津，此五藥重在補益肝腎明目；熟地黃補血滋陰，當歸補血活血，白芍養血柔肝，川芎活血行氣，丹參活血祛瘀，此四藥重在養血活血；黃芪補氣升氣，白術健脾益氣。諸藥合用，共奏補腎明目、益氣活血之功。

現代藥理學研究[16]表明，YXBS中多種中藥與近視鞏膜重塑有關。黃芪的主要成分黃芪多糖在腫瘤、糖尿病等多種疾病中促進了成纖維細胞的增殖及I型膠原的合成。在近視動物模型中，有研究[17]發現黃芪、當歸、丹參、五味子等中藥組成的含藥血清，能影響鞏膜成纖維細胞的增殖，從而參與鞏膜ECM 的合成與降解。此外，由枸杞子、菟絲子、五味子、車前子、丹參等組成的補精益視片，可上調近視眼中透明質酸的表達并下調轉錄因子激活蛋白c-jun的表達，參與鞏膜重塑，達到干預近視的效果[18]。還有研究[19]證實，在高度近視人眼鞏膜中，膠原纖維束明顯變細，單個膠原原纖維的直徑減小，這與本課題組前期研究結果一致，而YXBS 能有效延緩后鞏膜延伸，阻止近視進展[20]。結合本研究結果，推測YXBS 可能通過Wnt/β-連環蛋白信號通路，上調FDM 豚鼠鞏膜組織TGF-β2 的表達，使成纖維細胞的增生活性升高，影響鞏膜ECM 膠原蛋白的合成及降解，調節鞏膜重塑，進而抑制纖維鞏膜變薄，提高鞏膜抵抗力，有效抑制近視進展。

綜上所述，本研究發現YXBS 可通過上調FDM豚鼠鞏膜組織中TGF-β2 的表達，調節鞏膜重塑，延緩鞏膜變薄，控制近視發展。本研究可為臨床養血補腎方的應用提供一定理論基礎。