基于新孢鐮刀菌的花生果腐病抗性評價方法研究

李步陽 焦 鎮 崔順立 孫偉明

（1.河北科技師范學院農學與生物科技學院/河北省作物逆境生物學重點實驗室 河北 秦皇島 066000；2.河北農業大學 河北 保定 071001；3.河北科技師范學院海洋資源與環境學院 河北 秦皇島 066000）

花生（Arachis hypoaea L.）是世界上廣泛種植的油料作物和經濟作物。 截至2021 年末，我國花生種植面積達到473 萬hm2，位居世界第2 位[1]，花生油產量為324.8 萬t，約占世界總產量的1/2[2]。花生產業在我國國民經濟和社會發展中具有重要地位[3-4]。 花生果腐病是一種世界性的嚴重病害[5-6]，最早發現在美國，之后在各國花生種植區普遍發生，北美[7]、澳洲[8]、亞洲[9]、非洲[10]等地均有花生果腐病的發生。花生果腐病在我國山東[11]、河北[12-13]、吉林[14]、河南[15]等地發生嚴重，尤其是重茬地塊有逐年加重的趨勢[16]。

據國外研究報道，不同地域花生莢果腐爛的病原菌存在差異[17]。可引起花生莢果腐爛的病原菌主要包括腐霉菌（Pythium sp.）[18]、立枯絲核菌（Rhizoctonia sp.）[19]、花生黑腐病菌（Cylindrocladium paraasiticum）[20]、鐮刀菌（Fusarium sp.）[19]、白 絹 病 菌（Sclerotium rolfsii）[22]、小菌核菌 （Sclerotium minor、Chalara elegans）[21-22]和侵脈新赤殼菌 （N.vasinfecta）（現用名F.neocosmosporiellum）[23]。 國內已報道的花生果腐病病原菌有新孢鐮刀菌 （F.neocosmosporiellum）[23-29]、 尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）[30]、群結腐霉菌（P.myriotylum Drechsl）[31]和立枯絲核菌（R.solani）[32]。這些研究結果顯示，花生果腐病病原菌的種類存在地域差異， 即使同一省份不同年份鑒定出的病原菌種類也不盡相同。

利用病原菌接種離體植物組織進行初步抗病性評價或鑒定是科研工作者經常采用的方法。 目前，研究人員利用群結腐霉菌、 麗赤殼菌和尖孢鐮刀菌等花生果腐病病原菌進行室內離體或活體盆栽接種，從而建立了室內（盆栽）花生種質資源果腐病抗性鑒定的方法。 然而，以新孢鐮刀菌為花生果腐病病原菌進行室內（盆栽）抗性評價的方法還未見報道。 本研究利用離體花生果接種新孢鐮刀菌， 以果殼發病面積為分級標準獲得莢果病情指數， 通過聚類分析獲得了基于離體花生莢果室內接種病原菌的抗性評價方法， 為離體花生莢果接種病原菌抗性評價方法的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花生種質資源由中國農業科學院油料作物研究所、 河北農業大學及河北省農林科學院糧油作物研究所提供。 新孢鐮刀菌JNH1-2、HH-1-2 和XL-3 為本實驗室保藏的花生果腐病病原菌菌株， 分別分離自邯鄲市大名縣、 秦皇島市昌黎縣及石家莊新樂市的花生果腐病發病莢果。

1.2 試驗方法

試驗于2022 年在河北科技師范學院昌黎校區微生物實驗室進行。 將病原菌JNH1-2、HH-1-2 和XL-3分別接種于PDA 平板，在28℃條件下培養2 d，培養皿加入5 mL 含0.1%吐溫的無菌水， 制成105個/mL分生孢子懸浮液，備用。

將新鮮健康的R5 時期離體花生莢果進行表面消毒：用自來水沖洗干凈，75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗1 次，滅菌吸水紙吸干表面水分；5%次氯酸鈉消毒3 min，無菌水沖洗4 次，吸干表面水分。 表面消毒的2 個花生品種 （高感品種PI162857 和抗病品種PI196622）[33]離體莢果分別浸沾接種病原菌JNH1-2、HH-1-2 和XL-3 分生孢子懸浮液， 每個處理30 個莢果， 以無菌水為空白對照。 接種后的莢果置于直徑為180 mm 培養皿中在28℃黑暗保濕培養， 10 d后調查發病情況， 依據致病力情況確定病原菌代表性菌株。

利用篩選出來的病原菌代表性菌株按照上述方法對32 份花生種質資源進行離體花生莢果病原菌接種試驗。

1.3 病害分級方法

病原菌離體接種試驗采用的病害分級方法：0 級，無腐爛癥狀；1 級，0～10%腐爛癥狀；2 級，10%～20%腐爛癥狀；3 級，20%～30%腐爛癥狀；4 級，30%～40%腐爛癥狀；5 級，40%～50%腐爛癥狀；6 級，50%～100%腐爛癥狀。 按照莢果果皮腐爛面積占比調查莢果發病情況，計算莢果病情指數。

病情指數＝∑（各級發病莢果數×各級代表值）/（總果數×最高級值）×100

發病率＝發病株/總株數×100%

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用Microsoft ExceL 2017 進行數據整理， 用SPSS 21.0 統計軟件進行數據的處理與分析。利用歐式距離法（euclidean distance）計算品種間距離，采用最遠鄰元素法進行系統聚類分析。

2 結果與分析

2.1 新孢鐮刀菌的致病力測定

3 株病原菌對2 個花生品種表現出不同的致病力， 結果表明， 高感品種PI162857 發病率均大于80%， 病情指數為67.22～69.44； 抗病品種PI196622發病率為40.00%～53.33%，病情指數為30.56～36.67。其中，病原菌XL-3 接種離體花生莢果的發病率和病情指數均為最高，致病力最強，因此選擇新孢鐮刀菌XL-3 為病原菌代表性菌株開展基于室內離體花生莢果的抗性評價試驗（表1）。

表1 不同地區接種病原菌后花生莢果發病情況

2.2 基于室內離體花生莢果的抗性評價方法建立

32 份種質資源的離體花生莢果接種新孢鐮刀菌10 d 后進行病害分級，計算莢果病情指數（FDI），結果顯示，供試材料的FDI 變化范圍為10.56～69.44，其中湛紅2 號的FDI 最低，為10.56，中花24 的FDI 最高，為69.44。 以FDI 為聚類分析的統計指標，當閾值為5.5 時，可將供試花生種質資源聚為6 類（圖1）。第Ⅰ類有4 份資源， 病情指數為65.00～69.44， 屬于HS 類型； 第II 類有5 份資源， 病情指數為40.67～44.44，屬于MS 類型；第Ⅲ類有4 份資源，病情指數為51.33～55.56，屬于S 類型，第IV 類有8 份資源，病情指數為28.00～36.67，屬于MR 果腐病的資源類型；第Ⅴ類有5 份資源， 病情指數為10.56～16.67， 屬于HR 類型； 第Ⅵ類有6 份資源， 病情指數為18.67～25.33，屬于R 類型。 為了便于分析統計，基于室內離體花生莢果的花生果腐病抗性評價方法為：HR，0＜FDI≤15；R，15＜FDI≤25；MR，25＜FDI≤40；MS，40＜FDI≤50；S，50＜FDI≤65；HS，FDI＞65（表2）。

圖1 基于FDI 不同花生種質資源對果腐病抗性聚類分析譜系

表2 室內32 份花生種質資源抗性鑒定結果

3 討論與結論

花生果腐病是一種嚴重的土傳病害， 并且有逐年加重趨勢。 近年來引起了國內外學者的廣泛關注，但目前僅主要停留在對花生果腐病病原菌及其致病性的研究上， 關于花生抗果腐病室內抗性評價方法的建立研究較少。

本研究首先對新孢鐮刀菌的3 種病原菌菌株進行致病性鑒定， 以篩選出致病性最強的生理小種，并用其制備的孢子懸浮液侵染離體花生莢果， 然后進行抗性評價分析， 最終建立了基于室內離體花生莢果的抗性評價方法。于靜等[34]采用盆栽花生活體接種群結腐霉菌（P.myriotylum）的試驗方法，在幼苗期、 開花下針期、 結莢期和飽果成熟期進行。 此方法操作較為煩瑣， 試驗周期較長， 但可明顯提高花生果腐病接種后的發病率。陳明娜等[35]利用麗赤殼菌（Calonectria sp.）在花生苗期、盛花期、漿果期采用掩埋噴灌的接種方法對17 個花生品種的爛果率進行統計并分析， 建立了一種花生種質資源果腐病抗性鑒定的方法。 該方法能夠同時對多個花生種質資源進行果腐病抗性的鑒定，結果準確可靠，重復性好，對抗果腐病花生品種的培育及抗病機制的研究具有重要意義。 王冕等[36]利用一種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） 接種花生幼苗離體子葉， 并進行劃傷處理，后期調查記錄各品種的發病癥狀、病斑大小及發病率， 并由此建立了快速篩選花生抗果腐病種質資源的方法，篩選花生抗果腐病種質資源的方法，實驗結果直觀性強，易于分級鑒定，能夠快速、高效率地鑒定大量種質資源， 大大縮短了種質鑒定的篩選周期，快速為花生抗病育種提供優質資源。 于靜等[37]采用自然病圃鑒定法， 篩選出豫航花7 號為高抗花生果腐病的品種， 中花24 為高感花生果腐病的品種，這與本研究結果一致， 驗證了本試驗中基于室內離體花生莢果抗性評價方法的科學性與可行性。

本試驗采用基于花生果殼腐爛面積的病害分級方法， 將供試花生種質資源的果殼腐爛面積分為0 級，無腐爛癥狀；1 級，0～10%腐爛癥狀；2 級，10%～20%腐爛癥狀；3 級，20%～30%腐爛癥狀；4 級，30%～40%腐爛癥狀；5 級，40%～50%腐爛癥狀；6 級，50%～100%腐爛癥狀。 因在進行室內離體侵染時極少存在爛果仁的情況，一般病害表現都出現在莢果果殼上，故將病害分級標準劃分為7 個等級， 可使試驗結果更為客觀、準確。