電子煙用棉芯中高關(guān)注度化學成分的非靶向篩查和初步風險評估

李 丹，梁進欣，吳學峰，吳思亮，董 犇*，梁晶晶，李馨鐸，任照芳，鐘懷寧，陳 勝，鄭建國

1. 廣州海關(guān)技術(shù)中心 國家食品接觸材料檢測重點實驗室（廣東），廣州市越秀區(qū)先烈中路100 號 510075

2. 深圳霧芯科技有限公司，深圳市寶安區(qū)新安街道龍井社區(qū)建安一路9 號 518104

3. 深圳神州經(jīng)緯技術(shù)服務(wù)有限公司，深圳市寶安區(qū)新安街道龍井社區(qū)建安一路9 號 518104

在電子煙發(fā)展初期，使用玻璃纖維繩作為霧化導油材料［1-3］，該材料在靜置過程中，不吸收煙油，很容易產(chǎn)生絮狀物，消費者擔心絮狀物可能進入肺部而威脅人體健康［4-6］，因此，這種材料作為電子煙霧化芯的使用量逐漸減少。相反，棉芯導油具有還原度高，儲油量大，導油性好，煙味飽滿真實、煙霧濃密和口感更佳等優(yōu)點。但棉芯作為直接接觸高溫煙油和煙霧的安全性尚未明確，且其分析技術(shù)的缺失導致難以開展系統(tǒng)性風險監(jiān)測和安全評估工作。因此，亟需開展針對中國電子煙用棉芯材料中高關(guān)注度化學成分［7］檢測技術(shù)的相關(guān)研究。電子煙霧化器中棉芯的化學成分比較復雜，當吸食電子煙而接觸產(chǎn)生的化學成分并超量進入人體時，會威脅消費者的身體健康。國內(nèi)外專門針對電子煙用棉芯的分析方法和安全評估的研究尚未見報道，一些研究主要是關(guān)于電子煙器件中不同器件和條件對氣溶膠中縮水甘油［8］、丙烯醛［9］、苯［10］、無機元素［11］、煙堿［11］和酚類［12］等有毒有害化學成分釋放量的影響。但利用上述研究結(jié)果對于來源于霧化芯的高關(guān)注度化學成分不能有效、快速地進行測試和評估。因此，亟需建立一種高效、快速、高通量的定性和定量分析方法，對棉芯的安全性進行評估以監(jiān)測可能存在的風險。

全二維氣相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜（Two-dimensional gas chromatography-tandem quadrupole time-of-flight high-resolution mass spectrometry, GC×GC-QTOF-MS）具有峰容量大、靈敏度和分辨率高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用在非靶向篩查領(lǐng)域［13-14］。超高效液相色譜-四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜（Ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight high-resolution mass spectrometry,UPLC-QTOF-MS）可提供母離子信息和豐富的子結(jié)構(gòu)信息等，被視為未知物分析的有力手段［15］。電感耦合等離子質(zhì)譜法（Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）可有效避免光譜干擾，能同時檢測多種元素，檢測低限可達痕量級水平。為了對電子煙產(chǎn)品中的棉芯進行嚴格的質(zhì)量管控，本研究中使用上述3種技術(shù)分別對電子煙用棉芯本身，以及在使用過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性、半揮發(fā)性和不揮發(fā)性化學成分及元素進行非靶向篩查和分析，考察其是否釋放潛在的風險化學成分而影響人體健康，旨在為對棉芯的安全性風險評估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

電子煙用棉芯樣品A（天然纖維）、樣品B（人造纖維），由某電子煙品牌生產(chǎn)企業(yè)提供。

C6～C40正構(gòu)烷烴混合物（≥99%）、庚醛（≥99%）、十三烷（≥99%）和水楊酸甲酯（≥98%）（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；甲酸、甲醇（≥99%，色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；鄰苯二甲酸丁芐酯-d4（標準品，≥98%，北京曼哈格生物科技有限公司）；鄰苯二甲酸、己二酸二（2-乙基己基）酯（標準品，≥98%，上海麥克林生化科技股份有限公司）。

1290-6546超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀、8890-7250 全二維氣相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；SSM1800型固態(tài)調(diào)制器（雪景電子科技有限公司）；PAL RSI 120自動進樣器（瑞士CTC Analytics AG 公司）；iCap RQ ICP-MS 電感耦合等離子體發(fā)射光譜-質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；JS703C電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；Ethous-up微波消解儀（美國Milestone 公司）；Milli-Q50 超純水儀（美國Merck Millipore 公司）；聚醚砜微孔濾膜（孔徑0.45 μm，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

揮發(fā)性化學成分：分別稱?。?.16±0.01）g 樣品A、（0.19±0.01）g 樣品B 于頂空瓶中，直接或充氮氣1 min 后密封；放入230 ℃烘箱中烘15 min，冷卻至室溫后取出，進行GC×GC-QTOF-MS分析。

半揮發(fā)性化學成分和不揮發(fā)性化學成分：分別稱?。?.80±0.01）g 樣品A、（0.95±0.01）g 樣品B 于圓底燒瓶中，分別加入30 mL 95%乙醇、30 mL異辛烷，回流60 min。每種模擬液分別取6 mL于兩個試管中，其中，一個氮吹至1 mL，過微孔濾膜，將濾液進行GC×GC-QTOF-MS 分析；另一個氮吹至干，隨即用1 mL 甲醇復溶，過微孔濾膜，將濾液進行UPLC-QTOF-MS分析。

分別稱?。?.80±0.01）g 樣品A、（0.95±0.01）g樣品B 于頂空瓶中，加入2 mL 丙二醇后，直接或充氮氣1 min；密封后放入230 ℃烘箱中烘15 min，取出冷卻至室溫，分別用6 mL 95%乙醇、6 mL異辛烷于40 ℃下超聲提取1 h。每種模擬液分別取6 mL于兩個試管中，其中，一個氮吹至1 mL，過微孔濾膜，將濾液進行GC×GC-QTOF-MS 分析；另一個氮吹至干，隨即用1 mL甲醇復溶，過微孔濾膜，將濾液進行UPLC-QTOF-MS分析。

元素：分別稱?。?.16±0.01）g 樣品A、（0.19±0.01）g 樣品B 至聚四氟乙烯消解罐中，并各加入5～8 mL 硝酸, 封蓋，預反應(yīng)1 h，然后在60 ℃保持5 min，升溫至120 ℃保持5 min，最后在160 ℃下保持40 min 后，冷卻至室溫；將消解液全部轉(zhuǎn)移至50 mL 塑料容量瓶中，用純水定容后搖勻，過微孔濾膜，將濾液進行ICP-MS分析。

以上各條件處理樣品時，同時制作不加棉芯樣品而其余操作步驟完全一樣的全過程空白樣品。

1.2.2 儀器條件

（1）GC×GC-QTOF-MS條件

色譜柱：HP-5MS弱極性毛細管柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）和中極性二維（2D）DB-17 毛細管柱（1.00 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）；固相微萃取針纖維為聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子篩（PDMS/DVB/C-WR，10 mm，美國Agilent 公司）；萃取溫度：80 ℃；萃取時間：30 min；解吸附時間：5 min；樣品分析前，將SPME 萃取頭在260 ℃老化10 min；色譜柱升溫程序：40 ℃（5；分流模式：不分流；載氣：氦氣，流速1.2 mL/min；連接口溫度：260 ℃；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：35～400 amu；掃描速率：100 spectra/s；溶劑延遲：5 min。

（2）UPLC-QTOF-MS條件

色譜柱：Poroshell EC-C18柱（150 mm×3.0 mm×2.7 μm，美國Agilent公司）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫條件：0～1.50 min，5% B；1.50～25.00 min，5%～98% B；25.00～32.00 min，98%B；32.00～32.10 min，98%～5% B；32.10～35.00 min，5% B；流速：0.35 mL/min；進樣量：3 μL；質(zhì)量掃描范圍：100～1 000 amu；掃描速率：4 spectra/s；干燥氣流速：8 L/min；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細管電壓：4 000，3 500 V；噴嘴電壓：1 000 V；毛細管出口電壓：150 V；錐孔電壓：65 V；碰撞能量梯度：10，20，40 eV。

（3）ICP-MS條件

測量模式：動能歧視(Kinetic energy discrimination, KED)；半導體制冷溫度：2.7 ℃；等離子體排氣壓力：> 50 Pa; 等離子體功率：1 550 W；霧化氣流量: 1.0 L/min；系統(tǒng)真空度：< 5×10-5Pa；蠕動泵速率: 40 r/min；渦輪泵頻率：> 800 Hz；冷卻氣流速：14 L/min；輔助氣流速：0.8 L/min；進樣吸取時間: 60 s；沖洗時間：45 s。

1.2.3 定性分析

采用Canvas 2.0［雪景電子科技（上海）有限公司］軟件對GC×GC-QTOF-MS檢出的揮發(fā)/半揮發(fā)性化合物進行定性，要求化合物質(zhì)譜圖與NIST17譜庫的匹配度≥700，并且參考了化合物的保留指數(shù)RI。

利用MassHunter Qualification 10.0（美國Agilent 公司）軟件對UPLC-QTOF-MS 檢出的不揮發(fā)性化合物定性。通過自動提取MS/MS、匹配自建數(shù)據(jù)庫分子式（使用標準品建立），篩選匹配得分≥80 的化學成分，經(jīng)空白減法、化合物裂解規(guī)律、數(shù)據(jù)庫二級質(zhì)譜圖、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（如MassBank, https://.ass.ank.eu/; PubChem, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）二次對比等方式鑒定化合物。

只有在3 個平行樣中同時被定性的化合物才被認為是檢出該化學成分；如果僅在一個樣品中檢出的化合物則不予考慮；如果化合物在2個平行樣中被檢出，則需通過檢查二維色譜圖以及相應(yīng)保留時間的質(zhì)譜圖進一步確認。此外，通過比較疊加的二維色譜圖進行驗證，以提高化合物定性的準確性和可靠性。同時人工進行峰對齊以避免一維和二維的保留時間以及色譜圖錯位。

1.2.4 定量/半定量分析

針對GC×GC-QTOF-MS 檢出的揮發(fā)性和半揮發(fā)性的脂肪族含氧化合物、非芳香族碳氫化合物和芳香族化合物，分別采用庚醛、十三烷和水楊酸甲酯進行定量和半定量。針對UPLC-QTOF-MS檢出的不揮發(fā)性化合物，采用鄰苯二甲酸丁芐酯-d4和己二酸二（2-乙基己基）酯作為標準品對正模式下檢出的環(huán)狀化合物和鏈狀化合物進行半定量；對負模式下檢出的所有化合物，采用鄰苯二甲酸作為標準品進行半定量。所有半定量標準品均用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.10、1.0、5.0、10和20 mg/L的標準溶液，繪制標準曲線。樣品中各種被檢出化學成分的質(zhì)量分數(shù)按公式（1）計算。

式中：x為樣品中檢出化學成分的質(zhì)量分數(shù)，mg/kg；c為定量或半定量濃度，mg/L；c0為空白樣品質(zhì)量濃度，mg/L；V1為樣品提取體積，mL；V2為樣品測試用體積，mL；V3為樣品定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 暴露量計算

根據(jù)前期進行的消費者消費習慣調(diào)研，約60%的電子煙消費者每天抽吸煙油的量約為0.7 mL。本研究中進行評估時采用3倍從嚴處理的方式，假設(shè)消費者每天抽吸煙油的量為2 mL，則樣品中檢出化學成分的暴露量按照公式（2）進行計算。

式中：Exp為暴露量，μg/d；x為樣品中檢出物的質(zhì)量分數(shù)，mg/kg；m為樣品質(zhì)量，g；V0為每天抽吸煙油的量，mL/d；V為1顆煙彈中煙油的總量，mL。

消費者抽吸的煙油量按2 mL/d計；樣品A（天然纖維）質(zhì)量為0.165 g，1顆煙彈中對應(yīng)的煙油的總量為2 mL；樣品B（人造纖維）質(zhì)量為0.199 g，1顆煙彈中對應(yīng)的煙油的總量為3 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 棉芯中需關(guān)注的主要化學成分分析

2.1.1 元素

在樣品B中檢出Ti，檢出量為3 170 mg/kg；樣品A中無檢出。推測Ti可能來源于無紡布中添加TiO2所導致。添加TiO2可增強無紡布的力學性能［16］。

2.1.2 有機物

兩種樣品A 與B 中共檢出72 種有機物，結(jié)果見表1和表2，其中，大部分是揮發(fā)性化學成分，半揮發(fā)和不揮發(fā)的化學成分較少。通過classfire［17］（https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/）將所有檢出物分為了8類。如圖1所示，脂類和類脂類化學成分（Lipids and lipid-like molecules）在樣品A和B中檢出最多，分別有17 和16 種，分別占檢出成分總數(shù)的33.3%和29.6%。樣品A中含氧有機物（Organic oxygen compound）和碳氫化合物（Hydrocarbon）類各有7種，所占比例均為13.7%。在樣品B中含氧有機物和碳氫化合物分別有12 和10 種，分別占檢出成分總數(shù)的22.2%與18.5%。對于有機硅化合物（Organosilicon compound），只在樣品B中檢出了硅酸乙酯，占1.9%。

表1 兩種棉芯在不同條件下檢出的揮發(fā)性化學成分①Tab.1 Volatile chemical components detected in two kinds of wicking cotton under different conditions

表2 兩種棉芯在不同條件下檢出半揮發(fā)性和不揮發(fā)性化學成分的質(zhì)量分數(shù)Tab.2 Mass fractions of semi-volatile and non-volatile chemical components in two kinds of wicking cotton at different conditions（mg·kg－1）

對兩種樣品檢出化學成分的質(zhì)量數(shù)進行對比，結(jié)果見圖2?？芍?，總體上兩種樣品以質(zhì)量數(shù)在200 Da左右的化學成分為主，樣品A的化學成分最高質(zhì)量數(shù)（340.334 1 Da）大于樣品B（298.287 1 Da），同時，兩樣品檢出質(zhì)量數(shù)的中位數(shù)相當（A: 186.198 4 Da; B: 179.025 6 Da）。這是因為檢出的大部分化學成分以易揮發(fā)性成分為主；并且對比看來，有氮氣保護前處理檢出的揮發(fā)性化學成分更多，其中大部分為烷烴、烯烴和醛醇類等化學成分，推測可能是在加熱情況下被氧化成了其他化學成分。

圖2 兩種樣品檢出化學成分分子質(zhì)量對比小提琴圖Fig.2 Violin plots of molecular mass of detected chemical components in two samples

兩種樣品檢出化學成分的質(zhì)量分數(shù)分布情況見圖3a，除樣品B 中糠醛（7.85 mg/kg）和糠醇（11.59 mg/kg）外，兩種樣品中檢出化學成分的質(zhì)量分數(shù)均在3 mg/kg以下，絕大部分檢出化學成分的質(zhì)量分數(shù)較為接近。使用Toxtree3.1 對檢出化學成分進行基于毒理學關(guān)注閾值（Threshold of toxicological concern，TTC）法則的Cramer 分級［18］，對檢出化學成分的風險性進行初步研究，結(jié)果見表1，其分布情況見圖3b，共有18種屬于Class Ⅲ的化學成分，50種屬于Class Ⅰ的化學成分，以及4種屬于Class Ⅱ的化學成分。其中，檢出濃度最高的糠醛和糠醇均屬于Class Ⅲ的化學成分，需要引起安全關(guān)注。同時，檢出Class Ⅲ化學成分說明樣品存在一定風險，需要進一步進行評估。

圖3 兩種樣品檢出化學成分的質(zhì)量分數(shù)對比蜜蜂群圖［19］（a）和檢出化學成分基于TTC分類情況柱狀圖（b）Fig.3 Bee group plots of concentration of chemical components in two samples（a）and bar graph of detected chemical components based on TTC category（b）

2.2 初步風險評估

對檢出化學成分進行暴露量計算的結(jié)果見表1和表2，其中，有9種化學成分的暴露量高于SCT值，包括糠醇、糠醛、二乙醇胺和Ti等。利用產(chǎn)品質(zhì)量研究學會（The Product Quality Research Institute，PQRI）提出的檢出化學成分的暴露量進行的浸出物安全性分析，其分析流程如圖4所示。結(jié)果表明，除糠醇和糠醛外，其他7種化學成分均未列入流程中標準法規(guī)的致癌化學成分清單，進一步參考文獻［21］核查其結(jié)構(gòu)，排除其中屬于警示結(jié)構(gòu)的化學成分。此外，計算出Ti 的暴露量為421 μ g/d，超過QT 值（Qualification threshold，界定閾值）。因此，重點評估暴露量高于QT值的化學成分（Ti）以及暴露量高于SCT值的致畸、致癌和致突變化學成分（糠醇、二乙醇胺）。

圖4 檢出化學成分的風險評估分析流程Fig.4 Flow chart of risk assessment of detected chemical components

根據(jù)美國 EPA（Environmental Protection Agency，美國環(huán)境保護署）發(fā)布的《人類健康評價手冊，補充指南：標準默認暴露因子更新版》（2014）［22］以及GB/T 16886.17—2005 中對可瀝濾物允許限量的規(guī)定［23］，本風險評估中假設(shè)一個70 kg體質(zhì)量的成人每天空氣的攝入量為20 m3。采用來自歐洲化學品管理局（European Chemicals Agency，ECHA）某種化學成分的一般人群或職業(yè)人群經(jīng)吸入途徑的健康指導值，該值通過危害評估推導的無作用劑量（Derived no effect level，DNEL）值乘以空氣攝入量計算得到；對于無吸入暴露途徑毒理學數(shù)據(jù)的化學成分采用經(jīng)口途徑的危害評估DNEL 值進行評估。將化學成分的暴露量與健康指導值進行比較，評估其對人體健康危害的可能性，若低于健康指導值則表明其對人體健康產(chǎn)生危害的可能性比較低。同時通過PubChem［24］（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）提取化學成分的其他毒理學數(shù)據(jù)庫信息，包括聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會（Joint Expert Committee for Food Additves，JECFA），美國國家職業(yè)安全衛(wèi)生研究所（National Institute for Occupational Safety and Health，NIOSH）的數(shù)據(jù)庫信息等。綜合考慮各種限量值，取最低限量值進行健康指導值的推算。由表3可知，在本研究的背景下，兩種棉芯中需評估的4種高關(guān)注化學成分的暴露量均遠低于健康指導值，對人體健康產(chǎn)生危害的可能性比較低。

表3 重點化學成分評估暴露量Tab.3 Exposure assessment of key chemical components

3 結(jié)論

①在兩款樣品中共檢出8 個類別72 種化學成分，其中，大部分為揮發(fā)性化學成分，檢出化學成分的質(zhì)量分數(shù)大多在3 mg/kg 以下。②基于TTC 法（Threshold of toxicological concern，毒理學關(guān)注閾值）篩選出了18 種屬于Cramer Ⅲ的化學成分，通過PQRI（The Product Quality Research Institute，產(chǎn)品質(zhì)量研究學會）提出的浸出物SCT 值（Safety concern threshold，安全關(guān)注閾值）和QT 值（Qualification threshold，界定閾值）進一步篩選出暴露量較高、可能具有潛在風險的9 種有機物和金屬元素Ti。③對暴露量最高的糠醇、糠醛、二乙醇胺和Ti 4種化學成分進行風險評估，結(jié)果表明其暴露值均遠低于健康指導值。④以上研究結(jié)果表明，基于丙二醇研究體系，本研究中所使用的兩種電子煙用棉芯所檢出化學成分的暴露量均遠低于健康指導值，對人體健康產(chǎn)生危害的可能性較低。