重慶煙區煙草靶斑病病原菌鑒定及菌絲融合群分析

黃可珍，靳瑞瑞，陳 姍，張 帥，秦平偉，孫現超，陳國康，陳海濤

1. 西南大學植物保護學院，重慶市北碚區天生路2 號 400715

2. 中國煙草總公司重慶市公司酉陽分公司，重慶市酉陽縣鐘多鎮和平路99 號 409800

3. 中國煙草總公司重慶市公司彭水分公司，重慶市彭水縣紹慶街道阿依路111 號 409600

4. 中國煙草總公司重慶市公司煙葉分公司，重慶市江北區五江路20 號 400023

煙草靶斑病是一種煙草葉部病害，感染該病害的煙葉形成有同心輪紋的不規則病斑，病斑后期破裂穿孔。該病害具有潛育期短、流行速度快的特點，在溫暖濕潤條件下可反復侵染、大面積傳播，防治難度大［1］，嚴重影響煙葉產量和質量，一旦流行會造成巨大的經濟損失［2］。煙草靶斑病于2005年在我國遼寧丹東被發現［3］，隨后迅速蔓延至全國各煙區［4-5］。該病害病原菌的有性世代為瓜亡革菌［Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk］，無性世代為立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）是一個復合種，根據菌絲融合分類法［6］可將其劃分為不同的融合群，已報道的立枯絲核菌融合群共有14 個（AG-1～AG-13 和AG-BI）［7］，其中，引起煙草靶斑病的融合群為AG-2、AG-3、AG-4、AG-5 和AG-6［8-10］。關于煙草靶斑病病原菌融合群的相關研究已有報道。例如，Sun 等［10］通過形態學和rDNA-ITS 序列分析明確引起貴州畢節煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-6 融合群。徐傳濤等［11］對四川瀘州煙草靶斑病病原菌進行了分離、鑒定，發現該病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），經測定將其歸為AG-3融合群。2021至2022年重慶市涪陵區武陵山鄉、武隆區接龍鄉、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣等煙區均發生了煙草靶斑病，為明確這些煙區煙草靶斑病的病原菌，采集發病株的典型發病葉片，采用組織分離法對病原菌進行分離、純化，通過形態學觀察及分子生物學分析對病原菌進行鑒定，并調查重慶主要煙區煙草靶斑病的發生情況，以期掌握煙草靶斑病在重慶煙區的危害特點，為該病害的科學防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為云煙87。用于病原菌分離的煙草病葉樣品采集于重慶黔江區水市鄉、武隆區接龍鄉、涪陵區武陵山鄉、萬州區孫家鎮、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣煙區煙田的感病煙株。立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3 融合群標準菌株保存于西南大學植物保護學院。

1.2 試驗方法

1.2.1 病害調查

參照文獻［12］的方法，于2022 年5 月至8 月對重慶市黔江區水市鄉、武隆區接龍鄉、涪陵區武陵山鄉、萬州區孫家鎮、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣煙草靶斑病的發生時間及煙株發病率進行調查。

1.2.2 病原菌的分離和純化

采用常規組織分離法［13］分離病原菌。取病健交界處葉片組織，將其剪成小塊，經75%（體積分數）乙醇和5%（質量分數）次氯酸鈉溶液消毒后，用無菌水漂洗3次。消毒后的葉片組織接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，置于28 ℃恒溫培養箱中黑暗培養，待菌落長出后將菌絲挑取至新的PDA 培養基上純化培養5 d，獲得純化菌株。將純化菌株轉移到PDA斜面試管中保存。

1.3 純化菌株的致病性測定

將保存的菌株轉到PDA 培養基上，于28 ℃恒溫條件下培養5 d，按照柯赫氏法則對其致病性進行驗證。采用菌絲塊接種法［14］，對健康云煙87 葉片進行有傷接種。選取5～6 葉期煙株中下部葉片，用無菌針頭刺4 個小孔，再用打孔器取直徑為5 mm 的菌絲塊，菌絲面朝下置于葉片傷口處，將棉花用無菌水濕潤后覆蓋在菌絲塊上保濕，對照處理接種直徑為5 mm 的無菌PDA 培養基塊。每個處理接種2 片葉，重復3 次。將接種后的煙株置于28 ℃恒溫溫室中，葉片發病后，于病健交界處分離病原菌進行鑒定。

1.4 菌絲融合群的鑒定

采用玻片對峙法［15］將1.2 節中的純化菌株與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3融合群標準菌株進行對峙培養，24 h后觀察其菌絲融合情況。

1.5 病原菌的16S rDNA擴增及序列分析

隨機選取13 個純化菌株在PDA 培養基上于28 ℃條件下培養，7 d 后刮取菌絲，采用翌圣生物科技（上海）股份有限公司真菌基因組DNA 提取試劑盒提取病原菌DNA，提取過程嚴格按照說明書操作。采用真菌核糖體基因內轉錄間隔區通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對病原菌的rDNA-ITS 序列進行擴增。PCR 擴增反應體系（25 μL）：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取10 μL PCR 產物用1%（質量分數）瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司對擴增產物測序。將得到的序列使用NCBI網站的Blastn在線工具進行同源性比對，并下載相關菌株的基因序列，利用MEGA 11軟件以鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 病害調查及病原菌的分離和純化

經調查發現，黔江區水市鄉、武隆區接龍鄉、涪陵區武陵山鄉、萬州區孫家鎮、酉陽土家族苗族自治縣、彭水苗族土家族自治縣均有煙草靶斑病發生。其中，彭水苗族土家族自治縣煙株發病時間為5 月中下旬，酉陽土家族苗族自治縣煙株發病時間在6月上旬，黔江區水市鄉煙株發病時間為6月上旬，萬州區孫家鎮、涪陵區武陵山鄉和武隆區接龍鄉煙株發病時間為7月中下旬。該病害在酉陽土家族苗族自治縣和彭水苗族土家族自治縣的煙株發病率為40%～60%，而其他煙區該病害并未大面積流行，煙株發病率為5%～15%。對采集的病葉進行病原菌分離、純化，共獲得79 個菌株，詳細信息見表1。病原菌在PDA 培養基上生長時，菌落初期為白色，后變為黃褐色（圖1A），菌絲間夾角呈銳角或直角，分支處有明顯縊縮，且分支附近有隔膜，不產生孢子（圖1B），與Parmeter 等［6］描述的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）形態特征一致。

表1 病原菌的分離株及其地理來源Tab.1 Isolates of pathogenic fungi and their geographical origins

圖1 Rhizoctonia solani菌落及菌絲形態特征Fig.1 Morphological characteristics of fungal colonies and mycelia of Rhizoctonia solani

2.2 純化菌株的致病性測定

代表菌株YYCL11 的致病性測定結果顯示，健康煙草葉片在接種菌絲塊3 d后開始發病，前期病斑為不規則水漬狀，有明顯同心輪紋，且周圍伴有褪綠暈圈，后期病斑中心穿孔（圖2C），與病害調查發現的田間發病葉片癥狀一致（圖2A、圖2B），對照未發病（圖2D）。從接種發病的煙葉中再次分離、純化得到的菌株菌落形態及菌絲形態與菌株YYCL11 相同，證明菌株YYCL11對煙草葉片具有致病性，是引起重慶煙區煙草靶斑病的病原菌。

圖2 煙草靶斑病田間癥狀及菌株YYCL11的致病性測定Fig.2 Field symptoms of tobacco target spot and pathogenicity determination of strain YYCL11

2.3 菌絲融合群的鑒定

通過玻片對峙法，測定純化菌株與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2-1、AG-3 融合群標準菌株的菌絲融合情況，發現采集自重慶萬州區孫家鎮、黔江區水市鄉、武隆區接龍鄉、涪陵區武陵山鄉、酉陽土家族苗族自治縣和彭水苗族土家族自治縣的煙草靶斑病病原菌菌株均可與AG-3 融合群標準菌株的菌絲融合（圖3A），但不與AG-2-1 融合群標準菌株的菌絲融合（圖3B）。

圖3 菌絲融合群測定Fig.3 Determination of anastomosis group

2.4 病原菌的16S rDNA擴增及序列分析

對選取的13 個純化菌株DNA 的ITS 區域進行擴增，得到的片段長度大約為710 bp。Blastn 同源性比對結果顯示，13 個菌株的rDNA-ITS 序列與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）或其有性世代瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）的同源性高達97%～100%。以Rhizoctonia solaniAG-6 作為外群，使用MEGA 11 軟件以鄰接法構建系統發育樹（圖4），結果顯示13個菌株與Rhizoctonia solaniAG-3以97%的支持率聚于同一分支上。

圖4 基于16S rDNA構建的13個菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 13 isolates of Rhizoctonia solani based on 16S rDNA sequences

3 討論

本研究中調查的6 個煙區均有煙草靶斑病發生，可能是由于這些煙區為高海拔山區，6 至7 月份常出現連續降雨的情況，導致空氣濕度大、溫度偏低，有利于該病害在田間迅速流行。通過形態學觀察及分子生物學分析發現，引起重慶煙區煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-3融合群，而引起四川宜賓煙草靶斑病的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）為AG-5融合群［9］，引起廣西羅城煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-2 和AG-4 融合群［16］。引起不同煙區煙草靶斑病的立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）隸屬于不同菌絲融合群，這可能與地理環境及煙草品種等因素有關，但具體原因還有待進一步研究。

4 結論

通過病害調查發現煙草靶斑病在重慶市武隆區接龍鄉、涪陵區武陵山鄉、黔江區水市鄉、酉陽土家族苗族自治縣和彭水苗族土家族自治縣均有發生。從這些煙區的發病煙株上采集的病葉通過分離、純化及致病性測定后，得到79 個病原菌菌株，通過病原菌的形態特征觀察，將病原菌鑒定為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）。通過菌絲融合群測定以及rDNA-ITS基因序列系統進化樹分析，明確病原菌歸屬于AG-3 融合群，且病原菌菌株與Rhizoctonia solaniAG-3 的同源性達97%以上。因此，確定引起重慶煙區煙草靶斑病的病原菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-3融合群。