中性粒細胞在肝纖維化中的作用

齊婧姝 平大冰 孫鑫 胡旭東 彭淵 劉成海

肝纖維化是由多種病因如酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)、病毒性肝炎、膽汁淤積等導致的慢性肝損傷向肝硬化發展的關鍵病理過程,主要涉及肝細胞損傷、間質細胞活化、炎性細胞浸潤、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積等。近年來,以肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)與肝臟天然免疫細胞所構成的肝臟免疫微環境失衡而導致肝纖維化進展是重要的研究熱點,主要圍繞固有免疫細胞如巨噬細胞、自然殺傷細胞(natural killer cells, NK cells)等與HSC間相互關系展開研究[1],然而中性粒細胞在其中的作用卻鮮有關注。傳統觀點認為中性粒細胞屬于終末分化細胞,是一群有著抗菌功能的同質細胞,但越來越多的證據表明,中性粒細胞具有免疫抑制性,并參與多種器官纖維化進程[2,3],這表明中性粒細胞具有可塑性和異質性。本文就中性粒細胞在肝纖維化中的作用展開綜述。

一、中性粒細胞的基本生物學特征

中性粒細胞由骨髓造血干細胞發育而來,造血干細胞經多能祖細胞階段分化為粒細胞-單核細胞髓樣祖細胞,隨后在粒細胞集落刺激因子或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的作用下,經成髓細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞等階段,最終分化為成熟的中性粒細胞,釋放至循環中。經典的中性粒細胞從血液中募集至炎癥部位(包括肌肉、皮膚、腸系膜等),是通過選擇素-PSGL-整合素的途徑實現的。然而Senger團隊研究發現肝臟招募中性粒細胞并不遵循此經典途徑,他們認為中性粒細胞通過與肝臟內皮細胞的特異受體(Ⅰ型二肽酶)結合,從而募集至肝臟[4]。正常成人的中性粒細胞占循環白細胞的50%～70%,在小鼠中只有10%～25%[5,6],在人和小鼠外周血存活的半衰期分別為8小時和1.5小時[7,8]。盡管中性粒細胞的壽命很短,但其具有強大的趨化能力和吞噬功能,被認為是固有免疫系統的第一道防線。事實上,中性粒細胞是循環中最豐富的白細胞,它可通過吞噬、脫顆粒、產生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)等,形成中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NET)來捕獲并消滅入侵微生物[9]。同時,中性粒細胞釋放的髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)因子和ROS等亦可引起正常組織的損傷[10,11]。越來越多的證據表明,中性粒細胞在多種病因所致肝損傷和肝纖維化中扮演重要角色[12,13]。

二、中性粒細胞在不同病因所致肝纖維化中的作用

(一)脂肪性肝纖維化 脂肪性肝纖維化主要是指由ALD和NAFLD所引起的肝纖維化,其突出病理改變是肝組織內出現明顯的肝細胞脂肪變性[14]。

中性粒細胞在脂肪性肝纖維化中起著促纖維化和抗纖維化的雙重作用,其促肝纖維化的機制如下:①ROS。在高脂飲食+乙醇誘導的脂肪性肝纖維化模型中,Zhou等發現中性粒細胞來源的ROS可促進肝纖維化的進展[15]。中性粒細胞受到胞外信息(如激素、細胞因子、細菌等)的刺激時被激活,胞膜形成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)復合體,催化胞外O2生成大量ROS,如過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)等,引起肝細胞G2期細胞阻滯,導致肝細胞凋亡和壞死[16]后釋放腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)和轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β),并激活鄰近HSC[17,18]。②MPO。MPO是主要存在于中性粒細胞嗜天青顆粒中的一種血紅素蛋白,可作為中性粒細胞和NET的特異性標記物[19]。MPO可通過脫顆粒和NET釋放至胞外,發揮殺滅病原微生物及促纖維化的作用。在低密度脂蛋白受體缺陷小鼠(NASH易感)的模型中,MPO缺乏可減輕纖維化嚴重程度[20]。其機制如下:MPO可激活促纖維化細胞因子TGF-β,進而激活HSC[21];同時,釋放至胞外的MPO可催化H2O2生成高氧化性的次氯酸,其可失活基質金屬蛋白酶7,從而抑制ECM的降解[22];此外,與MPO相關的脂質過氧化產物可通過激活核轉錄因子(nuclear factor-kappa B,NF-kB)和誘導cmyb核表達刺激HSC激活[23]。③人中性粒細胞多肽-1(human neutrophil polypeptide-1,HNP-1)。HNP-1是儲存在中性粒細胞嗜天青顆粒中的一種防御素,即抗菌蛋白[24]。和MPO一樣,中性粒細胞在受到胞外信息被激活時,HNP-1會釋放到胞外。Hashimoto等予HNP-1轉基因小鼠膽堿缺乏性氨基酸飲食誘導脂肪性肝纖維化,發現中性粒細胞來源的HNP-1可誘導HSC激活并增殖,使膠原產生增加[25]。此外,HNP-1也可通過抑制肝細胞B淋巴細胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達,通過誘導肝細胞凋亡促進肝纖維化[26]。

中性粒細胞減輕肝纖維化的機制與微小RNA-223(microRNA-223,miR-223)密切相關。miR-223是中性粒細胞中表達最豐富的miRNA之一,并在中性粒細胞來源的胞外囊泡中特異性富集,miR-223在包括肝臟疾病在內的各種疾病的炎癥控制中發揮關鍵作用[27]。miR-223可以通過胞外囊泡從中性粒細胞傳遞到肝巨噬細胞,在肝巨噬細胞中,miR-223抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3),將促炎型巨噬細胞轉化為一種恢復表型,以減輕蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導的脂肪性肝纖維化模型[28];miR-223也可由中性粒細胞經胞外囊泡轉移至肝細胞,并通過靶向抑制肝細胞中的C-X-C基序趨化因子10(C-X-C motif chemokine 10,CXCL10),以及與pdz結合基序的轉錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)表達[29],遏止脂肪性肝纖維化的發生及發展。

(二)感染性肝纖維化 感染性肝纖維化由病毒、細菌、真菌等病原微生物引起的感染性肝病進展而來,以乙型和丙型肝炎病毒性肝炎最為常見。研究發現,由病毒性肝炎進展至肝纖維化的患者肝組織中,白細胞介素-17(interleukin-17, IL-17)陽性的中性粒細胞可在纖維化間隔和門脈區特異性累積,并與循環中IL-17表達呈正相關[30]。IL-17是一種具有多種生物學功能的細胞因子[31],通常IL-17即特指IL-17A[32]。除了由輔助性T細胞分泌,中性粒細胞亦為其主要來源[30]。IL-17以c-Jun末端激酶(JNK)依賴的方式增加HSC中的TGF-β受體,增加母親DPP同源物3(mothers against decapentaplegic homolog 3,SMAD3)的磷酸化,從而激活HSC[33]。IL-17A還可通過激活細胞外調節蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2),以及p38信號通路促進HSC激活和膠原蛋白表達,進而促進肝纖維化的發展[34]。因此IL-17+中性粒細胞可通過分泌IL-17在局部促進纖維化的進展,有望成為減輕甚至治愈肝纖維化的有效靶點。

(三)化學試劑誘導的肝纖維化 肝纖維化體內試驗的開展少不了小鼠肝纖維化模型的建立,而誘導小鼠肝纖維化最常見的化學試劑就是四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)。中性粒細胞在CCl4誘導的肝纖維化中發揮著促纖維化和抗纖維化的雙重作用。相關機制如下:①基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)。MMP-9又稱為明膠酶B,可儲存在中性粒細胞明膠酶顆粒中。Eiko Saijou等敲除小鼠trib1基因,人為使小鼠肝臟中性粒細胞增加,結果顯示:CCl4造模4周后,trib1敲除的小鼠與野生型小鼠肝臟相比,中性粒細胞顯著增多,而纖維化程度明顯減少,且中性粒細胞來源MMP-9顯著升高。這表明中性粒細胞可通過表達MMP-9,從而抑制金屬蛋白酶組織抑制劑1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP1),進而促進ECM的降解[35]。②中性粒細胞經胞外囊泡轉移至肝細胞及HSC的miR-223,可分別通過抑制肝細胞中TAZ-IHH-GLI2通路及靶向GLI家族鋅指蛋白2(GLI family zinc finger 2,GLI2)和血小板衍生生長因子受體α/β(platelet-derived growth factor receptor α/β,PDGFα/β),直接抑制HSC的激活和增殖,從而改善肝纖維化[36]。③其他。有研究發現CCl4小鼠肝纖維化模型中性粒細胞具有顯著的NETosis激活,MPO釋放,ROS暴發,從而促進肝纖維化[37]。此外,中性粒細胞下調丁酸受體G蛋白偶聯受體43,上調TNF-α和IL-6的分泌,從而促進腸道微生物易位,加重CCl4誘導的肝纖維化[38]。

(四)膽汁淤積性肝纖維化 由膽道結石、腫瘤、膽道寄生蟲病、膽管閉鎖、膽管炎等引起的慢性炎癥進展而來的肝纖維化稱為膽汁淤積性肝纖維化。在膽道梗阻誘導的膽汁淤積性肝纖維化模型中,中性粒細胞可抑制肝纖維化的進展。Harty等發現抑制中性粒細胞會降低基質金屬蛋白酶8(matrix metalloproteinase-8,MMP-8),又稱為中性粒細胞膠原酶的活性及膠原吸收,這表明中性粒細胞來源的MMP-8或其介導的固有肝臟MMP的激活是肝纖維化修復成功的關鍵[39]。

三、總結及展望

中性粒細胞是人體固有免疫的第一道防線,是第一個到達病灶的免疫細胞,較早產生免疫應答;而在肝纖維化中后期階段,中性粒細胞及其因子或產物可在多種病因引起的肝纖維化中發揮促進和抑制肝纖維化的作用,似一把“雙刃劍”。我們總結中性粒細胞促進纖維化作用機制主要如下:①產生ROS引起肝細胞凋亡壞死,釋放TNF-α/TGF-β,進而激活HSC。②釋放MPO通過激活NFκB和誘導cmyb核表達或直接激活TGF-β,進而誘導HSC活化;其氧化產物HOCl失活具有降解細胞外基質作用的MMP7。③表達HNP-1抑制肝細胞Bcl-2的表達,引起肝細胞的凋亡釋放TNF-α/TGF-β,進而激活HSC。④分泌IL-17通過激活ERK1/2、p38或JNK-SMAD3-TGFβ信號通路,激活HSC(圖1)。

圖1 中性粒細胞在肝纖維化中的作用機制

中性粒細胞抑制纖維化作用主要機制:①中性粒細胞可將富含miR-223的胞外囊泡轉移至肝細胞、肝巨噬細胞、HSC,并分別通過抑制TAZ-IHH-GLI2通路、促使肝巨噬細胞轉化為恢復型、靶向GLI2和PDGFα/β,抑制HSC的激活,進而減輕肝纖維化。②中性粒細胞來源的MMP9可中和TIMP1,進而促進纖維膠原降解(圖1)。

中性粒細胞在肝纖維化中的作用仍有較大的研究空間,體現在以下幾個方面:①機制研究不夠深入。例如,MPO怎么激活TGF-β?HNP-1如何抑制肝細胞Bcl-2表達?這些問題尚無研究涉及。②與肝纖維化相關的中性粒細胞亞群待研究。

肝內中性粒細胞的亞群包括腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils,TAN)、多性核髓源抑制細胞(polymorphonuclear-myeloid-derived suppressor cells,PMN-MDSC)等,然而它們與肝纖維化的關系尚無報道。Lemmers等雖發現在纖維化肝臟中存在一群分泌IL-17的中性粒細胞,這群中性粒細胞與肝纖維化的進展呈正相關,但尚無具體研究此群細胞的相關論述。解決并深入研究上述問題將為臨床抗肝纖維化治療提供靶點,促進抗肝纖維化藥物的研發。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。