柴蛻顆粒通過MAPK/Akt/NF-κB信號通路改善氣道炎癥治療咳嗽變異性哮喘的藥效及機制研究

楊涵 閆永煌 朱佩軒 吳宇杰 車宇娥 喬詩清 顏芳 張文婷 陳聰 蘇澤琦 張偲 王停

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma, CVA)是哮喘的一種特殊類型,是慢性咳嗽患者最常見的病因和典型哮喘的萌芽階段[1],發(fā)病與遺傳易感性、免疫系統(tǒng)紊亂、環(huán)境因素引發(fā)的氣道炎癥反復(fù)發(fā)作相關(guān)[2]。臨床研究表明,32.5%的CVA患者以嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil, EOS)性氣道炎癥為主要病理基礎(chǔ),15%的CVA患者為中性粒細(xì)胞(neutrophil, NE)性炎癥表型[3]。目前西醫(yī)常規(guī)治療存在療效不佳、復(fù)發(fā)率高、藥物不良反應(yīng)等局限性,中醫(yī)藥治療具備緩解咳嗽癥狀、降低復(fù)發(fā)率、副作用小等優(yōu)勢。柴蛻顆粒化裁于小柴胡湯、二陳湯、三子養(yǎng)親湯、過敏煎等經(jīng)典名方,具有祛風(fēng)解表,宣肺止咳、理氣化痰之功,臨床治療CVA多獲良效,但柴蛻顆粒治療咳嗽變異性哮喘的作用機制尚不明確。相關(guān)研究表明,細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/p38 mitogen activated protein kinase,ERK/p38 MAPK)信號通路是炎癥細(xì)胞分化、增殖、活化的關(guān)鍵調(diào)控因子,ERK/p38 MAPK通路磷酸化引發(fā)2型免疫應(yīng)答亢進與嗜堿性粒細(xì)胞(basophil, BA)脫顆粒誘發(fā)過敏性氣道炎癥[4];絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase, AKT)通過酪氨酸激酶級聯(lián)信號傳導(dǎo),正反饋調(diào)節(jié)下游核因子-κB p65(nuclear factor-κB p65, NF-κB)的轉(zhuǎn)錄,引起炎癥因子趨化及炎癥細(xì)胞募集,造成局部肺組織免疫炎癥浸潤[5]。本研究擬從整體動物水平,探討柴蛻顆粒治療咳嗽變異性哮喘的藥效及可能的作用機制,為CVA的中藥新藥研發(fā)提供研究思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

Hartley豚鼠,普通級,雄性,體質(zhì)量(350±20)g,10周齡,購自北京富龍騰飛實驗動物研究院有限公司,動物合格證號:SCXK(京)2018-0009,由北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)。環(huán)境溫度(22±2)℃,濕度40%～70%,自由攝食飲水,光照周期12小時明暗交替。動物實驗設(shè)計經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會論證,符合動物倫理學(xué)要求(倫理審查編號:BUCM-4-2021110109-4143)。

1.2 藥物

柴蛻顆粒方劑組成為柴胡(批號:20210624)、黃芩(批號:20210617)、法半夏(批號:20210620)、烏梅(批號:20210623)、蟬蛻(批號:20210615)、防風(fēng)(批號:20210605)、化橘紅(批號:20210104)、紫蘇子(批號:20201217)、炒萊菔子(批號:20210422)、浙貝母(批號:20210623)、桔梗(批號:20210121),藥材飲片購自北京本草方源集團有限公司。孟魯司特鈉片(杭州默沙東制藥有限公司,批號:U008805,規(guī)格:10 mg)。

1.3 試劑

卵白蛋白(ovalbumin, OVA)、乙?；?β-氯化甲基膽堿(美國Sigma公司,貨號分別為:A5503、A2251),氫氧化鋁[Aluminium hydroxide, Al(OH)3]凝膠(美國Thermofisher公司,貨號:77161),辣椒素(阿拉丁公司,貨號:V107238),豚鼠免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、白細(xì)胞介素4(interleukin-4, IL-4)、干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素10(interleukin-10, IL-10)(武漢華美生物工程有限公司,貨號分別為:CSB-E12102Gp、CSB-E10126Gu、CSB-E06763Gu、CSB-E06772Gu、CSB-E12915Gp),全蛋白提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,BC3710),BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:P0010),PBS緩沖液(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:G4202),5×SDS-PAGE變性蛋白上樣緩沖液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號:B1012),兔抗ERK單克隆抗體、兔抗p-ERK(Thr202/Tyr204)單克隆抗體、兔抗p38 MAPK多克隆抗體、兔抗p-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)單克隆抗體、兔抗Akt多克隆抗體、兔抗p-Akt(Ser473)單克隆抗體、兔抗NF-κB p65單克隆抗體、兔抗p-NF-κB p65(Ser536)單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司,貨號分別為:4695、4370、9212、4511、9272、4060、8242、3033),內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗(abcam公司,貨號分別為:ab8245、ab6721、ab6789),ECL發(fā)光液、10%預(yù)制膠(AQ翱擎,貨號分別為:AQ529、AQ123-01)。

1.4 儀器

R2003KE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海Senco科技有限公司),ZKXFB-2型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀、EVOSTMFL Auto 2型臺式自動化成像儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],GelView6000Plus智能圖像工作系統(tǒng)(廣州博鷺騰生物科技有限公司),小動物肺功能檢測系統(tǒng)(美國DSI公司),全自動血細(xì)胞分析儀(日本NIHON KOHDEN公司),多功能誘咳引喘儀(江蘇賽昂斯生物科技有限公司),Amersham Imager 680化學(xué)發(fā)光成像儀、MM400型高通量組織研磨機(德國Retsch公司)。

1.5 藥物制備

柴蛻顆粒由柴胡7 g、黃芩7 g、法半夏7 g、防風(fēng)7 g、化橘紅7 g、蘇子7 g、烏梅6 g、蟬蛻5 g組成,總生藥量為53 g,先加入藥材總質(zhì)量10倍的去離子水,煮沸后文火煮1.5小時,過濾收集藥液,再加入原藥材總質(zhì)量8倍的去離子水,煮沸后文火煮1.5小時。煎煮液200目濾布過濾后,合并2次藥液,趁熱離心(8000 r/min,10分鐘),減壓濃縮(60℃)至相對密度為1.25～1.30(60℃)。濃縮液置于真空干燥箱內(nèi),70℃干燥成干浸膏,所得干膏粉出膏率為31.7%。干浸膏粉碎,臨用前用動物飲用水配置成相應(yīng)濃度藥液。

1.6 動物造模與給藥

將32只Hartley雄性豚鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后,按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、柴蛻顆粒組、孟魯司特鈉組,每組8只。CVA模型采用徐方蔚等[6]所報道的方法,每只豚鼠肌注4% OVA溶液0.5 mL,同時腹腔注射 2% Al(OH)3凝膠0.2 mL致敏,致敏15天后以1%OVA溶液霧化連續(xù)攻擊13天,正常對照組以無菌生理鹽水連續(xù)霧化13天。致敏14天后,各組豚鼠每日霧化前0.5小時灌胃給藥,持續(xù)14天。末次灌胃24小時后,檢測各項指標(biāo),以模型組豚鼠咳嗽次數(shù)、氣道阻力、EOS較正常組升高且具有統(tǒng)計學(xué)意義,為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]。柴蛻顆粒臨床應(yīng)用劑量為每日生藥量53 g,按照成人60 kg,人和豚鼠體表面積比1∶6計算得豚鼠等效劑量[8]為5.3 g/(kg·d),孟魯司特鈉組按照0.001 g/(kg·d)給藥,豚鼠灌胃量按10 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)進行,其余各組每天給以等體積動物飲用水灌胃。

1.7 豚鼠咳嗽敏感性檢測

致敏豚鼠末次霧化攻擊48小時后,將豚鼠置于誘咳引喘儀霧化吸入10-4mol/L辣椒素溶液5分鐘,記錄自霧化開始各豚鼠的咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期。

1.8 豚鼠氣道阻力檢測

致敏豚鼠咳嗽敏感性檢測后,用1%戊巴比妥鈉4 mL/kg腹腔注射麻醉,行氣管插管后,置于密閉的全身體積描記箱中。采用清醒動物肺功能檢測系統(tǒng)(PFT系統(tǒng)),觀察并記錄豚鼠吸入濃度依次為0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的乙?；?β-氯化甲基膽堿后3分鐘內(nèi)氣道阻力的變化。

1.9 豚鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中炎癥細(xì)胞水平的測定

致敏豚鼠氣道阻力檢測結(jié)束后,腹主動脈取血處死。剪開胸腔,結(jié)扎左肺,行氣管插管,用PBS緩沖液進行支氣管肺泡灌洗。血生化分析儀測定BALF中各類白細(xì)胞比例。

1.10 豚鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察

肺組織4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,蘇木素—伊紅(HE)染色后中性樹膠封片,光鏡下觀察豚鼠肺組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)。參考Underwood S[9]提出的評估抗原攻擊豚鼠肺部炎癥變化的組織病理學(xué)評分系統(tǒng),對豚鼠肺組織支氣管炎癥浸潤、上皮細(xì)胞損傷、出血、水腫等方面進行評估,依據(jù)每個方面的肺組織損害嚴(yán)重程度分為5個等級進行評分。具體評分細(xì)則:未見炎癥細(xì)胞,氣管上皮損傷、充血、滲出(0分);輕微炎癥浸潤,上皮細(xì)胞損傷、充血、滲出(1～3分);少量炎癥浸潤,上皮細(xì)胞損傷、充血、滲出(4～6分);中度的炎癥浸潤,上皮細(xì)胞損傷、充血、滲出,支氣管平滑肌增生、管腔狹窄(7～9分);較多炎癥細(xì)胞聚集成團,較嚴(yán)重的氣管上皮損傷、充血、滲出,支氣管管腔狹窄(10～12分);大量炎癥細(xì)胞浸潤及滲出,嚴(yán)重的上皮細(xì)胞損傷、充血,支氣管管腔重度狹窄(13～15分)。

1.11 肺泡灌洗液中IgE、細(xì)胞因子檢測

支氣管肺泡灌洗后,離心取上清,酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測IgE、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)量,按ELISA說明書進行操作。

1.12 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肺組織蛋白表達(dá)量

剪取肺組織,稱取每份樣品質(zhì)量在100 mg左右,加入1 mL 蛋白裂解液(內(nèi)含RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF)提取肺組織總蛋白,BCA法測定蛋白水平,SDS-PAGE凝膠電泳,半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜完畢后,室溫封閉2小時。一抗稀釋比例分別為p-ERK(1∶1000)、ERK(1∶1000)、p-p38 MAPK(1∶1000)、p38 MAPK(1∶1000)、p-Akt(1∶2000)、Akt(1∶1000)、p-NF-κB p65(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)、GAPDH抗體(1∶2000),4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后,二抗(1∶3000)室溫孵育2 小時。TBST洗滌3次。滴加ECL發(fā)光液,采用智能圖像工作系統(tǒng)曝光顯色,使用Image J 6.0分析蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量,并進行均一化處理。

1.13 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 對豚鼠咳嗽次數(shù)和咳嗽潛伏期的影響

與正常組比較,模型組豚鼠咳嗽次數(shù)顯著增加(P<0.05),咳嗽潛伏期明顯縮短(P<0.05);與模型組比較,柴蛻顆粒組和孟魯司特鈉組豚鼠的咳嗽次數(shù)顯著減少(P<0.05),咳嗽潛伏期明顯延長(P<0.05)。見表1。

表1 柴蛻顆粒對豚鼠咳嗽次數(shù)及咳嗽潛伏期的影響

2.2 對豚鼠氣道阻力的影響

與正常組比較,模型組在0.6 g/L、0.8 g/L乙酰甲膽堿刺激下的氣道阻力顯著增高(P<0.05);與模型組比較,柴蛻顆粒組和孟魯司特鈉組在0.6 g/L、0.8 g/L激發(fā)濃度下的氣道阻力顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 柴蛻顆粒對乙酰甲膽堿激發(fā)下豚鼠氣道阻力的影響

2.3 對豚鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響

正常組豚鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰,上皮細(xì)胞排列整齊,支氣管周圍無異常增生、滲出及炎癥細(xì)胞浸潤;與正常組相比,模型組豚鼠可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤成團,上皮細(xì)胞脫落,毛細(xì)血管內(nèi)充血、水腫,粘液腺、平滑肌細(xì)胞增生,支氣管腔狹窄,病理評分顯著增加(P<0.01);與模型組相比,柴蛻顆粒組豚鼠炎癥細(xì)胞浸潤減少,上皮細(xì)胞輕度充血、滲出、脫落,平滑肌增生及支氣管狹窄有所改善,病理評分明顯降低(P<0.05)。見表3、圖1。

注:A:正常組;B:模型組;C:孟魯司特鈉組;D:柴蛻顆粒組。黃色箭頭:炎癥細(xì)胞浸潤情況;藍(lán)色箭頭:支氣管管壁增厚及管腔狹窄情況;黑色箭頭:上皮細(xì)胞充血、水腫情況。

表3 柴蛻顆粒對豚鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響

2.4 對豚鼠BALF中炎癥細(xì)胞水平的影響

與正常組相比,模型組豚鼠BALF中白細(xì)胞、EOS、NE、BA比例明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,柴蛻顆粒組豚鼠BALF中白細(xì)胞、EOS、NE、BA比例,以及孟魯司特鈉組豚鼠BALF中EOS、NE比例明顯降低(P<0.01),見表4。

表4 柴蛻顆粒對豚鼠BALF中炎癥細(xì)胞比例的影響

2.5 對豚鼠BALF中IgE、細(xì)胞因子的影響

與正常組相比,模型組豚鼠BALF中IgE、IL-4、TNF-α水平顯著增高(P<0.05),IFN-γ、IL-10水平顯著下降(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比,柴蛻顆粒組和孟魯司特鈉組IgE、IL-4、TNF-α含量明顯降低(P<0.05,P<0.01),IFN-γ含量明顯上升(P<0.05,P<0.01);柴蛻顆粒組豚鼠BALF中IL-10水平顯著提升(P<0.05),孟魯司特鈉組IL-10水平有升高趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

表5 柴蛻顆粒對豚鼠BALF中IgE、細(xì)胞因子的影響

2.6 對豚鼠肺組織蛋白表達(dá)量及磷酸化水平的影響

與正常組比較,模型組豚鼠肺組織中ERK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),p-ERK水平顯著增高(P<0.01);p38 MAPK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01),p-p38 MAPK水平顯著增高(P<0.05);Akt、p65 NF-κB表達(dá)量無顯著差異,p-Akt、p-p65 NF-κB水平顯著上升(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,柴蛻顆粒組和孟魯司特鈉組豚鼠肺組織中ERK蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05),p-ERK水平顯著降低(P<0.05);p38 MAPK蛋白表達(dá)無明顯變化,p-p38 MAPK水平顯著下降(P<0.05,P<0.01);Akt、p65 NF-κB蛋白水平無顯著差異,p-Akt、p-p65 NF-κB水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表6～7,圖2～3。

注:A:正常組;B:模型組;C:孟魯司特鈉組;D:柴蛻顆粒組。

注:A:正常組;B:模型組;C:孟魯司特鈉組;D:柴蛻顆粒組。

表6 柴蛻顆粒對豚鼠肺組織ERK、p-ERK、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)量及磷酸化水平的影響

表7 柴蛻顆粒對豚鼠肺組織Akt、p-Akt、p65 NF-κB、p-p65 NF-κB蛋白表達(dá)量及磷酸化水平的影響

3 討論

CVA是一類以氣道慢性炎癥基礎(chǔ)上的氣道高反應(yīng)性、氣道重塑為病理特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,發(fā)病機制與免疫紊亂導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。CVA歸屬于中醫(yī)學(xué)“風(fēng)咳”“哮咳”的范疇,核心病機為風(fēng)邪犯肺,子盜母氣,脾失健運,凝津成痰,伏藏于肺,成為本病的夙根。外邪引動伏痰,痰氣搏結(jié),上逆而咳[10]。柴蛻顆粒方中柴胡、黃芩為君藥,佐以防風(fēng)疏風(fēng)解表;紫蘇子、炒萊菔子、浙貝母理氣寬中,降氣祛痰;半夏、橘紅燥濕化痰,烏梅斂肺止咳,蟬蛻息風(fēng)止痙,桔梗引諸藥上行,共奏疏散風(fēng)邪,理氣化痰,宣肺止咳之功。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),柴蛻顆粒復(fù)方中主要成分木犀草素、漢黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇等具有抗炎、抗過敏、免疫調(diào)節(jié)與類激素作用等多種藥理活性[11-12]。本研究選取柴蛻顆粒臨床等效劑量探索其治療CVA的藥理機制,為臨床廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

臨床研究發(fā)現(xiàn),CVA典型表現(xiàn)為咳嗽敏感性與炎癥細(xì)胞水平的增高[13]。CVA患者存在以IL-4/IFN-γ比例升高為標(biāo)志的2型免疫應(yīng)答亢進與Ⅰ型免疫反應(yīng)減弱[14],引發(fā)局部組織過敏介質(zhì)釋放、炎癥細(xì)胞募集、炎癥因子IL-4、TNF-α分泌進而加劇免疫失衡[15]。炎癥遷延難愈、咳嗽反復(fù)發(fā)作引發(fā)氣道結(jié)構(gòu)重塑,從而形成不可逆的氣流受限[16]。若慢性炎癥未得到及時糾正,30%的CVA患者可能進展為典型哮喘[17],阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)是CVA防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在本研究中,柴蛻顆?？捎行Ы档虲VA豚鼠BALF中EOS、NE水平,抑制促炎細(xì)胞因子IL-4、TNF-α與過敏介質(zhì)IgE的釋放,同時提高抑炎細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10水平,顯著改善咳嗽癥狀。研究結(jié)果顯示柴蛻顆粒可能通過調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子與抑炎細(xì)胞因子平衡穩(wěn)態(tài),抑制過敏介質(zhì)與炎性物質(zhì)分泌,發(fā)揮以氣道抗炎為核心的治療作用。

MAPK參與炎癥細(xì)胞增殖、分化和運動等多個程序,調(diào)控細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng),ERK 1/2和p38 MAPK是其重要亞型。相關(guān)研究表明,ERK/p38 MAPK通路與嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞溶質(zhì)和囊泡低密度組RNase(EAR)的分泌相關(guān),抑制ERK/p38 MAPK通路能夠調(diào)控趨化因子介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞遷移[18],從而緩解CVA豚鼠氣道嗜酸性炎癥浸潤與病理損傷。NF-κB作為炎癥發(fā)生的重要途徑,是近年來炎癥和抗炎研究的焦點。Akt通過羧基末端內(nèi)部 Ser473 位點激活,與MAPK協(xié)同調(diào)控NF-κB 途徑活化與炎癥細(xì)胞的存活和凋亡。相關(guān)研究表明,Akt的異常表達(dá)促進NF-κB p65蛋白磷酸化,增強炎癥基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄[19]。Akt/NF-κB通路激活引發(fā)的中性粒細(xì)胞性炎癥與氣道平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)[20]。柴蛻顆粒緩解中性粒細(xì)胞炎癥浸潤的作用可能與抑制MAPK/Akt/NF-κB通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究中,柴蛻顆粒干預(yù)后,CVA豚鼠肺組織ERK/p38 MAPK通路與Akt/NF-κB通路的磷酸化水平顯著降低。本研究結(jié)果表明,柴蛻顆?？赡芡ㄟ^下調(diào)ERK/p38 MAPK通路表達(dá)減輕嗜酸性炎癥浸潤,抑制Akt/NF-κB信號通路活化以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡,減弱氣道平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。

綜上所述,MAPK/Akt/NF-κB通路的異常表達(dá)與CVA氣道炎癥密切相關(guān),柴蛻顆?？赡芡ㄟ^抑制 MAPK/Akt/NF-κB通路活化,下調(diào)促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá),中斷肺組織的炎癥級聯(lián)反應(yīng)以發(fā)揮抗炎作用,從而改善咳嗽癥狀與肺組織損傷,提高肺功能,發(fā)揮對CVA的治療作用。本研究明確了柴蛻顆粒對細(xì)胞因子平衡的調(diào)節(jié)作用,尚未對免疫細(xì)胞增殖、分化、極化的具體情況進行直接觀察。后學(xué)者可在本研究的基礎(chǔ)上,對柴蛻顆粒調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞平衡的作用進行深入探索。