半夏厚樸湯通過抑制內質網應激改善慢性間歇性低氧引起的小鼠心臟損傷

宋紀顯 陳琦 楊新櫟 安繼仁 趙亞碩 吉恩生

阻塞性呼吸睡眠暫停(obstructive sleep apnea,OSA)可引起慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia,CIH),誘導小鼠心肌損傷和心臟功能障礙[1]。CIH主要的病理特征是反復低氧/復氧循環,引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高和內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)進而導致心肌細胞凋亡[2-3]。內質網應激與多種心血管疾病密切相關,持續高水平存在會激活未折疊蛋白反應,造成細胞功能障礙和凋亡[4]。本課題組前期研究證實半夏厚樸湯可通過減少鐵沉積,抑制氧化應激和線粒體損傷,進而減輕CIH引起的心臟損傷[5-6],同時有研究發現CIH可以激活ERS導致主動脈血管重構[7],但是半夏厚樸湯是否可以通過抑制ERS反應發揮心臟保護作用尚不明確。因此為了進一步探討CIH引起心臟損傷的具體機制以及尋找半夏厚樸湯發揮心臟保護作用的其他潛在機制,課題組建立小鼠CIH模型,并觀察ERS在其中的作用以及半夏厚樸湯對ERS的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6N小鼠(SPF級,雄性),8周齡,體質量(20±2)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號: SYXK[冀]2017-005,于河北中醫藥大學科研中心動物中心進行飼養。該實驗已通過河北中醫藥大學倫理委員會審查(動物倫理編號:DWLL2020044)。

1.2 主要藥品與試劑

半夏厚樸湯所用中藥飲片均購自河北神威藥業有限公司,處方:半夏12 g、厚樸9 g、茯苓12 g、生姜15 g、蘇葉6 g。

RIPA裂解液(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:G2002)、蛋白酶抑制劑(Thermo Scientific,貨號:A32955)、Tween-20(北京索萊寶科技有限公司,貨號:9005-64-5)、BCA試劑盒(CoWin Biosciences,貨號:CW0014),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、過氧化氫酶(catalase, CAT)試劑盒(南京建成,貨號:A001-1、A007-1、A003-1)、TUNEL試劑盒(Vazyme Biotech,貨號:A112)、葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:GB11098)、CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)抗體(華安生物,貨號:ET17030)、內質網氧化還原1樣蛋白(endoplasmic reticulum oxidoreductin-1-like protein, ERO1L)抗體(Bioss公司,貨號:bs-10551R)、GAPDH抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號:GB15002)。

1.3 儀器設備

CIH氧艙(Oxyeycler Model 84,BioSpherix公司,美國)、小動物超聲成像系統(Vevo 2100, VisualSonics,加拿大)、生化分析儀(Phenom Pro,荷蘭)、多功能讀數儀(Varioskan LUX,Thermo Scientific,美國)、多功能成像系統(Vilber Fusion FX5 Spectra,Vilber Lourmat,法國)。

1.4 造模與分組

將C57BL/6N小鼠30只適應性飼養1周后隨機分為3組:正常組、模型組(CIH組)、半夏厚樸湯治療組(簡稱治療組)。模型制備共計3周,具體方法參考本課題組前期研究[5]。每日造模前,治療組小鼠灌胃給予半夏厚樸湯0.3 mL[7.02 g/(kg·d),此處參照漢代張仲景的《金匱要略》中的配方,按照臨床成人(70 kg)劑量的等效小鼠(20 g)劑量換算,即0.14 g/20 g],模型組與正常組小鼠灌服與治療組同等體積的生理鹽水。

1.5 指標檢測

1.5.1 超聲心動圖分析 造模結束前一天,進行小動物B超檢測。首先將小鼠放入麻醉盒中,沖入異氟烷對小鼠進行吸入麻醉,麻醉成功后將小鼠固定在操作板上,小鼠鼻腔持續給予異氟烷,并用脫毛膏將小鼠心區附近脫毛,暴露胸腔,將耦合劑擠在心區,用探頭檢測相關的指標。然后以QRS波和T波作為收縮期和舒張期的指標,結合圖像上二尖瓣的開閉情況測量左心室內徑。M型超聲記錄并測定射血分數(ejection fraction,EF)、左心室收縮末期內徑(LV-End systolic diameter,LVESD)、左心室舒張末期內徑(LV-End diastolic diameter,LVEDD)。所有測試小鼠至少取3個連續循環的平均值,并進行分析。

1.5.2 動物標本采集 造模結束后,采用0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,首先進行摘除眼球法取血,留存用于血清指標的檢測。然后將小鼠仰臥位固定于手術操作板上,暴露胸腔。迅速摘取心臟用4°C生理鹽水沖洗,放于無菌無酶凍存管內,置于液氮、-80°C保存,用于后續指標檢測。

1.5.3 心肌酶檢測 采用全自動生化分析儀分別測定各組小鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)、乳酸脫氫酶同工酶1(lactic dehydrogenase isoenzyme1, LDH1)的含量。每組小鼠隨機抽取6只進行檢測。

1.5.4 心臟組織中ROS檢測 取小鼠心臟組織,加入RIPA裂解液,3000 轉離心10分鐘,取上清液加入待測試劑,置于酶標儀波長550 nm處,分別測定SOD、CAT活力和MDA含量。每組小鼠隨機抽取3只進行檢測。

1.5.5 Western blot檢測 稱取小鼠心肌組織,按照組織重量∶裂解液=10 mg∶100 μL的比例加入預冷的RIPA裂解液,將組織剪碎后用研磨儀研磨1分鐘/次,共三次,然后用高速冷凍離心機4°C、12000 轉離心20分鐘,吸取上清液。用BCA法對蛋白濃度進行測定,選取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳,將蛋白轉移到PVDF膜上,用脫脂奶粉常溫封閉2小時后孵育GAPDH、GRP78、CHOP、ERO1L一抗4°C過夜,然后用TBST洗滌3次,每次15分鐘,常溫孵育山羊抗小鼠/兔二抗2小時后用TBST洗滌3次,每次15分鐘,用ECL進行化學發光成像。用Image J軟件對目的條帶灰度值進行分析,計算目標蛋白灰度值/GAPDH灰度值的相對表達。每組小鼠隨機抽取3只進行檢測。

1.5.6 TUNEL染色 每組小鼠取3只制備冰凍切片。將冰凍切片固定后,使用蛋白酶K修復。之后滴加破膜工作液覆蓋組織,常溫下孵育20分鐘,然后滴加buffer常溫孵育10分鐘進行室溫平衡。滴加反應液,37℃恒溫箱孵育2小時后滴加DAPI染液,避光室溫孵育10分鐘,復染細胞核。將切片洗滌甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像以檢測凋亡小體的數量,代表心肌細胞凋亡的情況。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 半夏厚樸湯對CIH暴露小鼠心臟功能的影響

超聲心動圖結果表明,與正常組相比,模型組小鼠左心室EF下降(P<0.05),LVESD、LVEDD均有不同程度的升高(P<0.05);與模型組相比,治療組小鼠EF提高,LVESD、LVEDD均有下降(P<0.05)。結果見表1、圖1。

圖1 各組小鼠超聲心動圖

表1 各組小鼠心臟功能指標EF、LVESD、LVEDD比較

2.2 半夏厚樸湯對CIH暴露小鼠血清CK、CK-MB、LDH1含量的影響

與正常組相比,模型組CK、CK-MB、LDH1的含量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,治療組的CK、CK-MB、LDH1含量明顯降低(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組小鼠血清中CK、CK-MB、LDH1的含量比較

2.3 半夏厚樸湯能對CIH暴露小鼠心臟組織SOD、MDA、CAT含量的影響

與正常組相比,模型組SOD和CAT含量明顯降低,MDA含量顯著升高(P<0.05);與模型組相比,治療組SOD、CAT含量上升,MDA含量下降(P<0.05)。結果見表3。

表3 各組小鼠心臟組織中SOD、MDA、CAT的含量比較

2.4 半夏厚樸湯對CIH暴露小鼠心臟組織GRP78、CHOP、ERO1L蛋白表達的影響

Western blot結果表明,與正常組相比,模型組GRP78、ERO1L、CHOP的蛋白表達量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,治療組GRP78、ERO1L、CHOP的蛋白表達量顯著下降(P<0.05)。結果見表4、圖2。

圖2 各組小鼠心臟組織中GRP78、ERO1L、CHOP蛋白表達情況

表4 各組小鼠心臟組織中GRP78、ERO1L、CHOP蛋白表達水平比較

2.5 半夏厚樸湯對CIH暴露小鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果顯示,與正常組相比,模型組心肌細胞中凋亡小體的數量明顯增多;與模型組相比,半夏厚樸湯治療組心肌細胞中凋亡小體的數量出現下降。結果見圖3。

圖3 各組小鼠心臟組織TUNEL染色(×400,鼠只=3)

3 討論

OSA作為一種慢性進行性疾病,其最主要的病理特征是CIH,能夠引起氧化應激和ERS水平升高,日久會導致包括心血管疾病在內的多種并發癥,所以在早期進行干預十分必要[7-9]。大多數OSA患者表現為形體肥胖,痰、氣是其主要的病理因素,貫穿整個發病過程[10],而半夏厚樸湯重在行氣降逆化痰[11],與OSA的病機基本相符。

本課題組前期研究證實,CIH過程中反復的低氧—復氧循環可以通過加重鐵沉積導致氧化應激,進而造成心肌線粒體損傷和心功能障礙,而半夏厚樸湯處理可以降低氧化應激損傷從而改善心功能[5-6]。內質網在對缺血—再灌注損傷的適應性反應中發揮核心作用,而CIH的缺氧/復氧變化類似于缺血—再灌注[12]。同時有研究證實,CIH也可以造成大鼠ERS水平的升高[13]。目前對于ERS在OSA病理生理反應中的作用研究較少,且半夏厚樸湯是否能通過降低ERS反應改善CIH導致的心臟損傷尚不明確。故本實驗在此基礎上探討半夏厚樸湯發揮預防心臟損傷的具體機制,進一步研究半夏厚樸湯與ERS反應之間的調控關系。

ERS參與多種心血管疾病的發生和發展,包括缺血性心臟病、心力衰竭、動脈粥樣硬化等[14]。有研究顯示,大鼠心肌缺血再灌注損傷時心肌ERS可顯著激活,而ERS預處理可以減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷[15-16]。當細胞受到缺血、缺氧的刺激時,未折疊蛋白和錯誤蛋白在內質網中積累,觸發未折疊蛋白反應稱為ERS[17]。長期的ERS可造成促凋亡蛋白GRP78、CHOP升高,通過ERO1L-肌醇1,4,5-三磷酸受體途徑觸發鈣依賴性ERS誘導細胞凋亡和細胞的功能障礙[18-19]。本研究結果顯示,半夏厚樸湯處理3周后,小鼠心功能明顯改善,心肌酶水平下降,心肌細胞凋亡情況減輕,說明半夏厚樸湯可以改善CIH引起的小鼠心臟損傷。后續結果表明,CIH暴露可以導致ERS關鍵蛋白GRP78、CHOP、ERO1L的表達明顯上升,ERS水平升高,而半夏厚樸湯可以下調這些蛋白的表達,這說明半夏厚樸湯可能是通過抑制ERS發揮心臟保護作用。

綜上所述,半夏厚樸湯可以改善CIH暴露引起的小鼠心功能障礙,其作用機制可能與抑制ERS反應、減輕細胞凋亡有關,這為半夏厚樸湯治療OSA引起的心臟損傷提供了新的實驗基礎和治療思路。