circBPTF靶向miR-98-5p對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響及其機制

趙海霞 劉林昊 曹盼盼

(河南省省立醫院,河南 鄭州 450000)

糖尿病腎病是糖尿病患者的重要并發癥之一,腎小管損傷是糖尿病腎臟病變的一個重要方面,而腎小管上皮細胞凋亡和炎癥是腎小管損傷產生的重要原因〔1,2〕。因此,防治糖尿病腎病的機制之一可能是阻滯高糖環境下人腎小管上皮細胞炎癥因子的分泌。證據表明環狀RNA(circRNA)與某些腎臟疾病的發病機制有關,可能參與多種腎臟疾病的病理過程,可以作為腎臟疾病的新生物標記〔3〕。circ溴結構域PDH指轉錄因子(BPTF)是衍生自BPTF外顯子的新型環狀RNA,研究報道敲減circBPTF通過靶向miR-384/LIN28B軸可減輕高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞的炎癥性損傷和氧化應激〔4〕。敲除circBPTF可通過miR-31-5p/RAB27A軸抑制膀胱癌的進展和復發〔5〕。但circBPTF對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響尚不清楚。microRNA已被認為是糖尿病性腎病發展的關鍵調節器,2型糖尿病患者中miR-98-5p表達水平降低〔6〕。miR-98-5p通過靶向Hmga2可減輕糖尿病腎病的上皮-間充質轉化和腎纖維化〔7〕。且miR-98-5p過表達抑制了氧葡萄糖剝奪/復氧誘導的神經元凋亡〔8〕。miR-98-5p將脂多糖(LPS)誘導的M1巨噬細胞極化轉變為M2巨噬細胞極化,并通過上調tribbles假激酶(Trib)1抑制炎癥〔9〕。但目前尚不清楚miR-98-5p對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響及其與circBPTF的靶向關系。本研究探討circBPTF對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響及對miR-98-5p的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM培養基(上海恒斐生物);腎小管上皮細胞(美國sciencell);si-circBPTF、anti-miR-98-5p、miR-98-5p及其陰性對照表達載體質粒(杭州鷹旸生物);熒光定量PCR試劑盒(上海吉瑪制藥);腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒〔亞科因(武漢)生物〕;蛋白提取試劑盒(美國Epigentek);凋亡檢測試劑盒(日本同仁研究所);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國BioAssay Systems)。

1.2細胞處理與分組 腎小管上皮細胞用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養,作為高糖(HG)組;用含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養的細胞作為正常對照(Con)組;將si-NC、si-circBPTF、miR-NC、miR-98-5p轉染至腎小管上皮細胞后,用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養,記為HG+si-NC組、HG+si-circBPTF組、HG+miR-NC組、HG+miR-98-5p組;將si-circBPTF分別與anti-miR-98-5p、anti-miR-NC共轉染至腎小管上皮細胞后,用含25mmol/L葡萄糖的DMEM培養基培養,記為HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p組、HG+si-circBPTF+anti-miR-NC組。

1.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)測定circBPTF和miR-98-5p表達 用TRIzol試劑根據制造商的方案從各組細胞中提取總RNA,對于miRNA和mRNA的逆轉錄,分別使用miRNA逆轉錄試劑盒和PrimeScript逆轉錄試劑盒根據制造商的說明合成cDNA。在ABI 7300系統上使用SYBR Green PCR試劑盒的標準方案對miRNA和mRNA進行熒光定量PCR,分別以GAPDH和U6為內參,用2-ΔΔCt法計算circBPTF和miR-98-5p的相對表達量。

1.4ELISA檢測TNF-α、IL-6水平 各組處理后收集上清液,在2 000 r/min下離心20 min。根據試劑盒說明,使用TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒分析TNF-α、IL-6的濃度。

1.5流式細胞術測定細胞凋亡 細胞(1×106)用胰蛋白酶消化,收獲并在冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌,在500 μl結合緩沖液中,用5 μl的碘化丙啶(PI)和10 μl的膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)在黑暗中染色10 min。采用EPICS XL-MCL FACScan采集熒光信號,并用FlowJo 8.7.1軟件進行分析。

1.6Western印跡評估蛋白表達 用放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解緩沖液加蛋白酶抑制劑提取總蛋白,使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒定量蛋白。裂解物中的蛋白質在10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離,電轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,然后在室溫下在5%脫脂牛奶溶液中阻斷1 h。B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗在4 ℃下孵育過夜,然后用相應的辣根過氧化物酶耦聯的山羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h,用電化學發光(ECL)檢測試劑對蛋白條帶進行可視化。用ImageJ軟件對蛋白片段強度進行定量。GAPDH為內參。

1.7雙熒光素酶報告實驗檢測circBPTF和miR-98-5p的靶向關系 使用StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預測circBPTF和miR-98-5p之間的潛在結合。將circBPTF的野生型(WT)和突變型(MUT)3′-UTR序列分別克隆到含有熒光素酶報告基因的pGL3啟動子載體中。將腎小管上皮細胞接種到24孔板中,培養至約70%的匯合度時,用LipofectamineTM3000將miR-NC、miR-98-5p與circBPTF WT或MUT熒光素酶載體共轉染。轉染24 h后,收集細胞,使用熒光素酶報告基因試劑盒進行分析,將熒光素酶報告基因活性歸一化為海腎熒光素酶活性。

1.8統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1circBPTF和miR-98-5p在高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷中的表達 與Con組比較,HG組circBPTF表達水平顯著增高,miR-98-5p表達水平顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 circBPTF和miR-98-5p在高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷中的表達

2.2抑制circBPTF表達影響高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷 與Con組比較,HG組腎小管上皮細胞IL-6、TNF-α、凋亡率及蛋白Bax表達顯著升高,蛋白Bcl-2表達顯著下降(P<0.05);與HG+si-NC組比較,HG+si-circBPTF組IL-6、TNF-α水平、凋亡率和蛋白Bax表達顯著下降,蛋白Bcl-2表達顯著增高(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

1～4:Con組、HG組、HG+si-NC組、HG+si-circBPTF組;圖2同圖1 抑制circBPTF表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡蛋白的影響

圖2 抑制circBPTF表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡率的影響

表2 抑制circBPTF表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥因子的影響

2.3circBPTF與miR-98-5p結合 StarBase軟件預測結果顯示circBPTF與miR-98-5p具有互補的核苷酸位點。見圖3。miR-98-5p與WT-circBPTF共轉染的細胞熒光素酶活性顯著下降(P<0.05),miR-98-5p與MUT-circBPTF共轉染的細胞熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。與pcDNA組(1.00±0.06)比較,pcDNA-circBPTF組miR-98-5p表達(0.53±0.04)顯著下降;與si-NC組比較(1.02±0.06),si-circBPTF組miR-98-5p表達(3.15±0.21)顯著增加(F=934.888,P<0.05)。見表3。

圖3 circBPTF含有與miR-98-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4miR-98-5p過表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響 與HG+miR-NC組比較,HG+miR-98-5p組IL-6、TNF-α水平、細胞凋亡率及蛋白Bax表達顯著下降,蛋白Bcl-2表達顯著增高(P<0.05)。見圖4、表4、圖5。

1～4:HG+miR-NC組、HG+miR-98-5p組、HG+si-circBPTF+anti-miR-NC組、HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p組;圖5同圖4 各組Bcl-2、Bax蛋白表達

圖5 各組流式細胞術檢測細胞凋亡

表4 miR-98-5p過表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的影響

2.5下調miR-98-5p表達逆轉了抑制circBPTF表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的作用 與HG+si-circBPTF+anti-miR-NC組比較,HG+si-circBPTF+anti-miR-98-5p組IL-6、TNF-α水平、細胞凋亡率及蛋白Bax表達顯著增高,蛋白Bcl-2表達顯著降低(P<0.05)。見圖4、圖5、表5。

表5 下調miR-98-5p表達逆轉了抑制circBPTF表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的作用

3 討 論

腎小管上皮細胞可分泌多種炎癥因子進入腎間質,加重腎間質的炎癥和纖維化進程,從而促進腎臟疾病的進展〔10〕。研究表明,circRNA的失調與糖尿病相關并發癥的病理生理密切相關〔11〕。研究報道,circ_0003928的干擾通過miR-151-3p/膜聯蛋白(Anx)a2減輕了HK-2細胞中高糖誘導的細胞凋亡和炎癥〔12〕。敲除circACTR2可降低高葡萄糖誘導的近端腎小管細胞的炎癥和纖維化〔13〕。本研究提示,抑制circBPTF表達可降低高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應。

研究報道,miR-98-5p通過抗凋亡和抗氧化應激保護小鼠免受腦缺血/再灌注損傷〔14〕。氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中miR-98-5p的表達下調;敲除lncRNA OIP5-AS1通過miR-98-5p/高遷移率族蛋白(HMG)B1軸可誘導ox-LDL誘導的HUVEC細胞增殖并抑制細胞凋亡,炎癥損傷和氧化應激損傷〔15〕。敲低lncRNA TTTY15可通過調節miR-98-5p/CRP軸減輕H2O2誘導的心肌細胞凋亡〔16〕。本研究說明,過表達miR-98-5p抑制了高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷。本研究發現circBPTF靶向下調miR-98-5p表達;且下調miR-98-5p逆轉了抑制circBPTF表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷的保護作用。