馬齒莧總黃酮調控LncRNA TTTY15減輕MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷

谷偉 馮英慧 楊繼雷

(河北北方學院附屬第一醫院全科醫學科,河北 張家口 075000)

帕金森病是常發生于老年人群的一種神經退行性疾病,其主要臨床特征為認知功能障礙,且已嚴重降低患者生活質量,帕金森病的發病機制較為復雜,氧化應激、炎癥反應與神經細胞凋亡等可能引起帕金森病的發生,1-甲基-4-苯基碘化吡啶(MPP+)可誘導活性氧的形成而促使神經細胞凋亡,并可用于建立帕金森病體外細胞模型〔1〕。目前主要采用藥物治療減緩帕金森病的發展,因而研發保護神經細胞的新型藥物具有重要意義,研究表明,部分重要具有抗氧化、抗炎等作用,并可能通過調控長鏈非編碼RNA(LncRNA)表達而清除過量的氧自由基而抑制神經細胞凋亡從而減輕帕金森病細胞損傷,其中LncRNA在帕金森病中表達異常,并可能作為藥物治療帕金森病的潛在作用靶點〔2,3〕。近年來,從植物中提取的黃酮具有抗炎、抗氧化等作用,研究發現馬齒莧總黃酮是馬齒莧的主要活性成分,且具有抗氧化、抗腫瘤等作用,還可通過增強海馬組織膽堿能的代謝而改善阿爾茨海默病小鼠的學習記憶能力〔4〕。目前尚未明確馬齒莧總黃酮在治療帕金森病方面的療效和作用機制。研究顯示,抑制LncRNA TTTY15表達的表達可減輕缺氧誘導的心肌細胞損傷〔5〕。通過靶基因預測顯示TTTY15與miR-7-5p存在結合位點,研究表明,miR-7-5p在MPP+誘導的神經細胞中表達下調,上調其表達可減輕細胞損傷〔6〕。目前,尚不清楚TTTY15/miR-7-5p是否在馬齒莧總黃酮治療帕金森病的過程中發揮作用。本研究建立帕金森病體外細胞模型,探討馬齒莧總黃酮是否可通過調控TTTY15/miR-7-5p表達改善帕金森病模型細胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 馬齒莧購自江西眾創興農生態農業科技;MPP+購自美國Sigma;人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH購自上海信裕生物Lipofectamine2000、TTTY15過表達載體(pcDNA-TTTY15)購自美國Invitrogen;si-TTTY15和miR-7-5p mimics及各自陰性對照物購自廣州銳博生物;凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶;乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Trizol試劑與miRNA提取試劑購自美國Thermo Fisher;反轉錄與實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑購自北京天根生化公司;兔抗人酶切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase)3抗體與二抗購自美國CST。

1.2構建帕金森病細胞損傷模型〔7〕SK-N-SH細胞培養于DMEM完全培養基中,于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱內培養,待細胞生長通融合度達到70%時加入含有0.2 mmol/L MPP+的DMEM培養基培養24 h,建立帕金森病細胞損傷,并記為MPP+組。同時取正常細胞記為Con組。

1.3馬齒莧總黃酮提取及實驗處理 取10 kg馬齒莧切碎,分別用70%乙醇提取3次,收集濾液后減壓回收,將浸膏混于水中,分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯提取3次,采用水浴蒸干溶劑,然后采用乙醇、氯仿清洗,加入蒸餾水后經水浴加熱溶解,再次采用乙酸乙酯提取,水浴蒸干溶劑,60 ℃干燥處理得到87 g馬齒莧總黃酮(獲得率0.87%)。SK-N-SH細胞以1×104個/孔接種于6孔板中,使用含10、30、100 μg/ml馬齒莧總黃酮〔8〕并分別含0.2 mmol/L MPP+的培養基培養24 h,分別記為MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組。采用脂質體法分別將si-NC、si-TTTY15轉染至SK-N-SH細胞,然后使用0.2 mmol/L MPP+干預細胞24 h,分別記為MPP++si-NC組、MPP++si-TTTY15組。采用脂質體法將pcDNA-TTTY15轉染至SK-N-SH細胞,然后使用100 μg/ml馬齒莧總黃酮和0.2 mmol/L MPP+共同干預細胞24 h,記為MPP++馬齒莧總黃酮+pcDNA-TTTY15組。

1.4噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 將各組細胞以1×104個/孔接種于96孔板培養24 h,每孔加入20 μl MTT溶液在37 ℃下繼續孵育4 h,小心棄去上清后每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),充分溶解后,應用酶標儀檢測各孔在490 nm處的光密度(OD)值并計算細胞增殖抑制率。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 用不含EDTA的胰蛋白酶對各組SK-N-SH細胞進行消化,取5×104個細胞加入500 μl結合緩沖液重懸細胞,然后分別加入5 μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)染液,充分混合后室溫避光孵育15 min,快速使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6檢測氧化應激指標LDH、SOD的活性與MDA的水平 收集各組SK-N-SH細胞培養上清液,通過對應試劑盒檢測細胞上清LDH、SOD的活性與MDA的水平,具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7qRT-PCR檢測TTTY15、miR-7-5p表達水平 采用RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA,并測定濃度。使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA 并進行qRT-PCR,使用PCR儀檢測TTTY15、miR-7-5p表達情況,TTTY15以GAPDH為內參,miR-7-5p以U6為內參,采用2-ΔΔCt法檢測目的基因相對表達量。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測TTTY15和miR-7-5p的靶向關系 將SK-N-SH細胞按照每孔1×104個接種于6孔板,采用脂質體轉染法將野生型質粒(wt-TTTY15)、突變型質粒(mut-TTTY15)分別與miR-NC、miR-7-5p mimics共轉染至SK-N-SH細胞,培養48 h后檢測細胞熒光素酶活性。

1.9Western印跡檢測Cleaved-caspase3蛋白表達量 各組細胞提取總蛋白,并測定蛋白濃度,使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醇胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白分離并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,將膜用脫脂牛奶封閉60 min,加入相應一抗:Cleaved-caspase3、GAPDH,在4 ℃孵育過夜,隨后加入二抗室溫下孵育90 min,使用電化學發光(ECL)試劑顯色ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.10統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1馬齒莧總黃酮對MPP+誘導的SK-N-SH凋亡的影響 與Con組比較,MPP+組細胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白表達均顯著升高(P<0.05);與MPP+組比較,MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組上述指標均顯著降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見表1、圖1、圖2。

圖1 馬齒莧總黃酮抑制MPP+誘導的SK-N-SH凋亡的影響

1～5:Con組、MPP+組、MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組圖2 各組Cleaved-caspase-3蛋白表達

表1 馬齒莧總黃酮抑制MPP+誘導的SK-N-SH凋亡和氧化應激

2.2馬齒莧總黃酮對MPP+誘導的SK-N-SH氧化應激的影響 與Con組比較,MPP+組LDH活性和MDA水平顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.05);與MPP+組比較,MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組LDH活性和MDA水平顯著降低,SOD活性顯著升高,且呈劑量依賴性(P<0.05),見表1。

2.3馬齒莧總黃酮對MPP+誘導的SK-N-SH中TTTY15和miR-7-5p表達的影響 與Con組比較,MPP+組TTTY15表達量顯著升高,miR-7-5p的表達量降低(P<0.05);與MPP+組比較,MPP++馬齒莧總黃酮10 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮30 μg/ml組、MPP++馬齒莧總黃酮100 μg/ml組TTTY15表達量顯著降低,miR-7-5p表達量顯著升高,且呈劑量依賴性,見表2。

表2 馬齒莧總黃酮對MPP+誘導的SK-N-SH中TTTY15和miR-7-5p表達的檢測

2.4抑制TTTY15對MPP+誘導的SK-N-SH凋亡氧化應激的影響 與MPP+組、MPP++si-NC組比較,MPP++si-TTTY15組miR-7-5p表達量明顯升高,細胞增殖抑制率、凋亡率和Cleaved-caspase3蛋白表達均顯著降低,LDH活性和MDA水平顯著降低,SOD活性顯著升高(P<0.05),見表3、圖3。

1～3:MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-TTTY15組圖3 抑制TTTY15對MPP+誘導的SK-N-SH凋亡的影響

表3 抑制TTTY15抑制MPP+誘導的SK-N-SH凋亡及氧化應激

2.5過表達TTTY15可逆轉馬齒莧總黃酮處理的MPP+誘導的SK-N-SH凋亡氧化應激的作用 與MPP++馬齒莧總黃酮組比較,MPP++馬齒莧總黃酮+pcDNA-TTTY15組miR-7-5p表達量顯著降低,細胞增殖抑制率、凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白表達顯著升高,LDH活性、MDA水平均顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.05),見圖4、表4。

1～3:MPP+組、MPP++馬齒莧總黃酮組、MPP++馬齒莧總黃酮+pcDNA-TTTY15組圖4 過表達TTTY15可逆轉馬齒莧總黃酮對SK-N-SH凋亡的影響

表4 過表達TTTY15可逆轉馬齒莧總黃酮對SK-N-SH凋亡氧化應激的作用

2.6TTTY15和miR-7-5p靶向關系的驗證 starbase預測顯示TTTY15與miR-7-5p存在結合位點,見圖5。與miR-NC組相比,轉染野生型wt-TTTY15和miR-7-5p細胞熒光素酶活性明顯降低(P<0.05),見表5。

圖5 TTTY15和miR-7-5p互補序列

表5 雙熒光素酶報告實驗

3 討 論

目前認為減輕神經細胞氧化應激和異常凋亡損傷可能是減緩帕金森病建站的重要因素,研究發現,中藥具有治療效果好、不良反應小等優點,闡明中藥對帕金森病的影響及其可能作用機制對中藥廣泛用于帕金森病的預防及治療具有重要意義〔9,10〕。已有研究表明,LncRNA在MPP+誘導的神經細胞損傷中表達異常,部分藥物可通過調控LncRNA的表達而減緩帕金森病的發展進程〔11〕。

馬齒莧具有較強的抗氧化作用且具有抗動脈粥樣硬化的作用,研究表明,馬齒莧總黃酮可通過增強心肌細胞抗氧化能力從而減輕缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷〔12〕。馬齒莧總黃酮可通過抑制心肌細胞凋亡從而減輕心肌缺血再灌注損傷〔13〕。馬齒莧總黃酮可通過抑制氧化應激、炎癥反應而減輕四氯化碳誘導的大鼠急性肝損傷〔14〕。本研究結果顯示,MPP+誘導的神經細胞增殖抑制率和凋亡率明顯升高,與Zhou等〔15〕研究結果一致,提示細胞損傷模型建立成功。本研究提示,馬齒莧總黃酮可促進MPP+誘導的神經細胞增殖并能抑制細胞凋亡。氧化應激會誘導細胞凋亡進而加重神經細胞損傷,本研究提示,其可通過抑制神經細胞氧化應激反應而抑制細胞凋亡進而減緩帕金森病的發展進程。

LncRNA在MPP+誘導的神經細胞中表達異常,但其是否可作用馬齒莧總黃酮治療帕金森病的潛在靶點仍需進一步探究,本研究提示,減輕MPP+誘導的神經細胞損傷可能與抑制TTTY15的表達,促進miR-7-5p的表達有關。研究表明,敲低TTTY15可通過調節miR-374a-5p/FOXO1表達而減輕心肌缺血/再灌注損傷〔16,17〕。TTTY15缺失可通過抑制氧化應激和細胞凋亡減輕缺氧引起的人臍靜脈內皮細胞損傷〔18〕。本研究提示,TTTY15可能通過負向調控miR-7-5p表達而加重MPP+誘導的神經細胞損傷。已有研究顯示,miR-7-5p表達在心肌缺血再灌注損傷中被下調,上調其表達通過促進細胞增殖而抑制凋亡率減輕心肌細胞損傷〔19〕。本研究提示,馬齒莧總黃酮可通過抑制TTTY15的表達而促進miR-7-5p的表達從而減輕MPP+誘導的神經細胞損傷。