銀杏葉提取物對異氟烷麻醉后大鼠神經(jīng)功能及認知功能的影響

王培 何元 侯蕾娜

(陜西省腫瘤醫(yī)院麻醉科,陜西 西安 710061)

術(shù)后認知功能障礙(POCD)是指在患者在麻醉蘇醒的一段時間內(nèi),輕者表現(xiàn)為記憶損害或健忘綜合征〔1〕,對指令反應(yīng)變遲緩,嚴重者會喪失判斷能力和語言概括能力,甚至導(dǎo)致人格改變,患者記憶力、注意力、理解力受損,給患者和家人帶來極大的不良影響〔2〕。若POCD持續(xù)時間過長,可能會導(dǎo)致患者社會活動、生活能力降低甚至喪失〔3〕。異氟烷是常用的新型全身吸入麻醉藥,誘導(dǎo)期較短,常用于小手術(shù)或者復(fù)合麻醉,極易引起麻醉過深,雖然在使用過程中給患者和醫(yī)務(wù)人員帶來很多便利,但難免會導(dǎo)致POCD出現(xiàn)〔4〕。過往研究發(fā)現(xiàn),銀杏葉提取物對大腦、心臟和血腦屏障等組織器官具有保護作用〔5〕。未有研究直接證明銀杏葉提取物對POCD有改善作用,本實驗旨在研究銀杏葉提取物對異氟烷麻醉下的大鼠的認知功能和神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1研究動物 選取40只8月齡SPF級Wistar大鼠,體質(zhì)量206～232 g,購置來源:杭州環(huán)特生物科技股份有限公司,動物許可證號:SCXK(浙)2022-0003,所有大鼠在無菌、相對濕度50%、室溫24 ℃的恒溫箱中進行喂養(yǎng),飲用水為超純水、所食用食物均經(jīng)過高溫消殺,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實驗操作均符合動物實驗倫理要求的相關(guān)規(guī)定,經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2分組與給藥 分組與建模:適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,選取大鼠40只,按照隨機分法,10只作為空白組,以朱霞等〔6〕大鼠模型為參照,其余30只大鼠均注射6%異氟烷(魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn);國藥準字H20020267)進行麻醉處理,麻醉3.5 h,根據(jù)情況適當追加麻醉。造模成功后,將30只大鼠分為建模組、抵抗組、治療組,各10只。給藥:治療組給予20 mg/kg銀杏葉提取物和100 mg/kg生理鹽水腹腔注射,抵抗組注射50 mg/kg銀杏葉提取物和100 mg/kg生理鹽水,空白組和建模組注射50 mg/kg二甲基亞砜和100 mg/kg生理鹽水,給藥48 h后進行相關(guān)指標檢測。

1.3逃逸潛伏期和記憶時間 Morris水迷宮實驗:對各組進行Morris水迷宮實驗訓(xùn)練,使用直徑110 cm,高45 cm的水池,于第三象限設(shè)置一個直徑10 cm的平臺,隱于水下。將大鼠在象限中央放入大鼠,訓(xùn)練大鼠尋找第三象限平臺,進行相關(guān)訓(xùn)練。定位航行訓(xùn)練:4組大鼠連續(xù)訓(xùn)練7 d,訓(xùn)練時,將大鼠從池壁4個位點放入水中(水溫保持恒定24 ℃),訓(xùn)練大鼠找到隱藏第三象限的水下隱蔽平臺,大鼠能夠找到并在平臺站立的時間為逃避潛伏期。每只大鼠每天從4個入水點分別訓(xùn)練1次,持續(xù)4 d,每次間隔時間為1 min。從第5天開始視為大鼠完成訓(xùn)練,持續(xù)進行強化訓(xùn)練,直至7 d完成。每組選取5只大鼠進行實驗。

1.4曠場實驗分析 分別于麻醉后1 d和2 d同時間進行曠場實驗分析,使用120 cm×120 cm×50 cm的黑色無蓋聚乙烯塑料箱,平均分為9格。每次放入一只大鼠于中央箱格內(nèi),自由探索10 min。

采用自動圖像監(jiān)視系統(tǒng)自動追蹤和記錄大鼠運動路程,并記錄大鼠行為和在中央格停留時間。每只大鼠檢測完成后,場地均進行消殺和痕跡去除。

1.5大鼠海馬組織病理形態(tài)觀察 進行行為實驗后,每組隨機抽取一只大鼠,予以麻醉處理,斷頭、去除顱骨,取出腦組織,于低溫快速剝離海馬組織,將海馬組織置于3%戊二醛固定液中低溫冷藏備用。于低溫快速剝離海馬組織,將低溫處理的海馬組織研磨均勻,1 500 r/min處理3 min。將冷藏的海馬組織使用70%丙酮處理15 min后,再次使用90%丙酮做二次處理,重復(fù)兩次上述步驟;將脫水處理后的海馬組織聚合固化為包埋塊,經(jīng)后續(xù)處理后,使用超薄切片機切割出40 nm的切片,放置于載網(wǎng),使用滴染液(醋酸鈾、硝酸鉛)染色10 min。將處理后的海馬組織切片用透射電鏡觀察,拍攝海馬組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。

1.6海馬組織氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒處理,將上文所得海馬組織溶液稀釋,放入孵育箱37 ℃溫育30 min,使用顯色劑處理,450 nm波長觀察吸光值,檢驗溶液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。

1.7Western印跡法檢相關(guān)蛋白 取大鼠海馬組織研碎之后,加入300 μl裂解液,混合均勻,低溫靜止1 h,以3 500 r/min離心10 min后,收集上層清液。將獲得的溶液采用二喹啉甲酸(BCA)檢測法,加熱使蛋白質(zhì)變形,再次離心10 min,取上層清液待檢。每孔上樣分離膠與濃縮膠60 μl,100 V恒壓電泳2 h,待溴酚藍達到膠底部時,停止操作。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,使用脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)印膜,TBST洗3次,2 min/次。加入核磷蛋白(c-FOS)、血清蛋白(SP)孵育。使用辣根過氧化物酶耦聯(lián)二級抗體山羊抗兔IgG室溫再次孵育,將其放入電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液中,使其顯色,成像系統(tǒng)對光密度進行分析B淋巴細胞-2基因相關(guān)X蛋白(Bax)的蛋白表達水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行方差齊性檢驗、重復(fù)測量的方差分析。

2 結(jié) 果

2.1逃逸潛伏期和記憶時間 如表1所示,與空白組相比,模型組、抵抗組、治療組第4、5、7天潛伏逃逸時間變長、記憶時間縮短,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,抵抗組、治療組第4、5、7天潛伏逃逸時間較短,記憶時間較長,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與治療組相比,抵抗組第4、5、7天潛伏逃逸時間較短,記憶時間較長,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組逃逸潛伏期和記憶時間

2.2曠場實驗 如表2所示,與空白組相比,模型組、抵抗組、治療組第1、7天停留時間變長、站立次數(shù)和跨格次數(shù)減少,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組對比,抵抗組、治療組第1、7天停留時間較短、站立次數(shù)和跨格次數(shù)較多,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與治療組對比,抵抗組第1、7天停留時間較短、站立次數(shù)和跨格次數(shù)較多,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組曠場實驗比較

2.3大鼠海馬組織病理形態(tài)觀察 如圖1所示,空白組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整,排列整齊,細胞呈極性排列分布;模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)分散,數(shù)量減少,排列紊亂無序,大部分細胞皺縮,部分細胞核固縮,細胞染色質(zhì)異常;相比較模型組,抵抗組和治療組CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)較為清晰,細胞排列整齊,少部分染色質(zhì)異常,小部分細胞核固縮;相比較治療組,抵抗組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)更清晰緊湊,排列更清晰,染色質(zhì)變異較少。

圖1 各組海馬組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.4海馬組織氧化應(yīng)激指標檢測 如表3所示,與空白組對比,模型組、抵抗組、治療組GSH-Px、SOD、GSH表達降低,MDA表達上升,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組對比,抵抗組、治療組GSH-Px、SOD、GSH表達升高,MDA表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與治療組對比,抵抗組GSH-Px、SOD、GSH表達較高,MDA表達較低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組氧化應(yīng)激指標及海馬組織Keap1、Nrf2、ARE mRNA相對表達水平比較

2.5Western印跡法檢測Keap1、Nrf2、ARE、Bax蛋白表達情況 如表3、圖2所示,與空白組相比,模型組、抵抗組、治療組腦組織Keap1、Bax、ARE表達升高,Nrf2表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,抵抗組、治療組Keap1、Bax、ARE表達降低,Nrf2升高具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與治療組相比,抵抗組Keap1、Bax、ARE表達升高、Nrf2表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 Western印跡檢測Keap1、Nrf2、ARE、Bax 蛋白表達

3 討 論

吸入性麻醉是指揮發(fā)性麻醉藥物經(jīng)過呼吸道,以氣體的方式吸入肺內(nèi),由肺泡進入血液循環(huán)而達到中樞神經(jīng)系統(tǒng),抑制中樞神經(jīng)從而暫時使機體意識、感覺、反射等部分張力減弱或消失的一種麻醉方法〔7〕。

異氟烷是常用的吸入性麻醉藥,適用于全身麻醉,麻醉效力小于付完和甲氧氟烷〔8〕。由于其麻醉深度容易控制,在臨床常用于小手術(shù)和腦部手術(shù)〔9〕。相關(guān)研究證實異氟烷作為全麻藥對患者的認知行為具有損害作用〔10〕。銀杏葉提取物具有廣泛生物學(xué)效應(yīng),對腦細胞具有保護和恢復(fù)作用〔11〕。

水迷宮實驗通過強迫實驗動物游泳,學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的實驗,用來測驗實驗動物對空間位置和空間定位的學(xué)習(xí)能力〔12〕。研究證明,水迷宮實驗中大鼠潛伏逃逸時間說明大鼠學(xué)習(xí)能力和認知能力,大鼠找到水中平臺和對環(huán)境的感知能力和海馬區(qū)有關(guān)〔13,14〕。大鼠海馬體積變小,導(dǎo)致創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙和記憶障礙〔15〕。本研究驗證了針對異氟烷所產(chǎn)生的POCD癥狀,銀杏葉提取物可以改善患者不良癥狀,對受傷害的海馬區(qū)保護和恢復(fù)具有正向效能。曠場實驗是將動物放置在一個封閉的平面區(qū)域中,觀察行為和活動的實驗〔16〕。從動物在劃分區(qū)域中活動的次數(shù)和軌跡分析動物神經(jīng)緊張度〔17〕。相關(guān)研究表明,站立行為反映動物對新環(huán)境的適應(yīng)情況和自身的興奮程度〔18〕。跨格次數(shù)反映的是對環(huán)境的探索程度〔19〕。中央停留時間反映大鼠對周圍環(huán)境的認知能力〔20〕。本研究說明,銀杏葉提取物對POCD大鼠的認知能力和記憶能力有保護和恢復(fù)效果,且存在較好保護能力。

認知功能障礙的病理進程和腦部蛋白的沉積及自由基氧化反應(yīng)有關(guān)〔21〕。氧化應(yīng)激狀態(tài)下,海馬組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡,進而導(dǎo)致認知功能障礙〔22〕。研究表明,GSH-Px是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶〔23〕。GSH是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽,具有抗氧化作用〔24〕。SOD又稱超氧歧化酶,MDA是過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,機體內(nèi)丙二醛上升則表示機體過氧化反應(yīng)劇烈〔25〕。本研究說明,銀杏葉提取物有助于降低機體內(nèi)過氧化反應(yīng),對POCD預(yù)防和治療有較好效果。

Keap1-Nrf2/ARE分為兩部分,一部分在細胞質(zhì),一部分在細胞核。Nrf2與上游Keap1特異性結(jié)合,Nrf2活性受到抑制,促進其激活進入細胞核內(nèi),并與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合。相關(guān)研究表明,Bax可促使細胞器釋放出某些信號分子,在這些信號分子作用下半胱氨酸蛋白酶活化,進而拮抗B細胞淋巴瘤-2的抗凋亡效應(yīng)而使細胞趨于凋亡,或者作用于線粒體膜,降低線粒體膜電位,使線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)開放,線粒體膨脹,使細胞進入凋亡程序進而誘導(dǎo)細胞凋亡〔26〕。Keap1-Nrf2/ARE通路是抗氧化應(yīng)激的核心通路之一,Keap1是重要阻遏蛋白,與Nrf2結(jié)合后存在于細胞質(zhì)中,當機體發(fā)生氧化應(yīng)激時,Nrf2被激活與Keap1接力,轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi),與ARE對應(yīng)位點結(jié)合,進而提升細胞抗氧化能力,促進細胞凋亡。本研究說明,銀杏葉提取物有效減輕機體氧化應(yīng)激反應(yīng),減少海馬組織細胞萎縮和染色質(zhì)變異,提升大鼠記憶能力和認知能力。