基于mTOR/S6K1通路探究CXCR3對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷、凋亡、自噬的影響

李明霞 楊謙 趙軼峰 張冰潔 王曉芳 趙婷 趙鐵軍

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1內(nèi)分泌科,河北 張家口 075000;2胃腸腫瘤外科;3張家口第一醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科;4河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)生物化學(xué))

糖尿病腎病是糖尿病患者最重要的并發(fā)癥之一。我國(guó)的發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì),目前已成為終末期腎臟病的第二位原因,僅次于各種腎小球腎炎〔1,2〕。糖尿病腎病過(guò)程中伴隨著足細(xì)胞的損傷,足細(xì)胞附著于腎小球基底膜的外側(cè),連同血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基膜一起構(gòu)成了腎小球血液濾過(guò)屏障〔3,4〕。趨化因子及其受體在急慢性糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,趨化因子受體(CXCR)3參與了足細(xì)胞在高糖下的炎癥因子釋放、組細(xì)胞損傷等重要過(guò)程〔5,6〕,本研究將通過(guò)沉默CXCR3探究CXCR3對(duì)組細(xì)胞的凋亡與自噬的影響,同時(shí)探究哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/蛋白核糖體S6蛋白激酶(mTOR/S6K1)信號(hào)通路在此過(guò)程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源 小鼠腎足組細(xì)胞MPC-5細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2主要試劑 RPMI1640、胎牛血清和青鏈霉素購(gòu)于Gibco;細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管等實(shí)驗(yàn)耗材購(gòu)自美國(guó)Corning公司;LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司;si-CXCR3、si-NC載體、由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自?shī)W淇洛譜生物科技有限公司;抗Bcl-2抗體(ab182858)、抗半胱天冬氨酸蛋白激酶(Caspase)-3抗體(ab184787)、抗mTOR(ab134903)、抗S6K1抗體(ab32529)、抗S6K1(phospho S424)抗體(ab47379)、抗GAPDH抗體(ab8245)及二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.3儀器設(shè)備 Allegra X-22R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼公司,德國(guó)),4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司),-80 ℃超低溫冰箱、Applied Biosystems 7500fast qPCR 儀、Multiskan SkyHigh全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo 公司), Labsystems Multiskan352酶標(biāo)儀(美國(guó)MS公司),DM-BA400-B 顯微鏡(美國(guó)Motic 公司), Western印跡電泳儀(北京市六一儀器廠),M3600蛋白質(zhì)掃描儀(清華紫光),Attune NxT流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染條件 小鼠腎足組細(xì)胞MPC-5細(xì)胞培養(yǎng)條件:未分化的小鼠腎足細(xì)胞使用10%胎牛血清 (FBS)、1%青霉素-鏈霉素及10 U/ml小鼠重組干擾素γ(γ-IFN)的RPMI1640培養(yǎng),置于33 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。誘導(dǎo)分化時(shí),將小鼠腎足細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中,使用無(wú)γ-IFN,含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14 d。對(duì)分化成熟的足細(xì)胞分為4組,模型組、NC組和si-CXCR3組分別予以30 mmol/L葡萄糖進(jìn)行高糖刺激48 h,對(duì)照組以5.5 mmol/L葡萄糖刺激。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染按照 LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,8 h后換液,去除LipofectamineTM2000,更換為完全培養(yǎng)基5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)〔7〕。

1.5小鼠腎足組細(xì)胞mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 在低溫及無(wú)酶環(huán)境中采用TRizol提取mRNA后,按照試劑盒進(jìn)行在冰上進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行qPCR,擴(kuò)增條件:95 ℃ 預(yù)變性10 min,95 ℃ 變性10 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 20 s,共35個(gè)循環(huán)。以通過(guò)溶解曲線和2-△△Ct計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量,試驗(yàn)中采用的引物順序:ATG5上游引物:5′-CAAGATGATCTGCCTGCTGACT-3′,下游:5′-ATGTCCGTGGAGTGCCTGA-3′;ATG7上游引物:5′-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,下游:5′-GCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′;Beclin-1上游引物:5′-ACTTCGCCTGTCAGTCATA-3′,下游:5′-GGTGAGGCAGGGTCCT-3′;CXCR3上游引物:5′-GACTCAAAGCCACCTCATTC-3′,下游:5′-GCCTTGCCTTCCTAAATACC-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGCCTACCTCCCTCGAAAG-3′,下游:5′-CAGACAGCCAGATAGACGGAC-3′。

1.6MTT法檢測(cè)小鼠腎足組細(xì)胞MPC-5細(xì)胞活力 按照細(xì)胞密度為1×104/ml對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整并將細(xì)胞懸液并接種于96孔板中,按照實(shí)驗(yàn)分組處理后,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h及72 h。每孔加入10 μl MTT工作液于培養(yǎng)箱孵育3 h,每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)后將6孔板置于搖床上低速震蕩15 min,震蕩晶物溶解后選擇490 nm波長(zhǎng),于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度(OD)值,細(xì)胞存活率的計(jì)算方式為:細(xì)胞存活率 =(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔〔9〕。

1.7細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將各組MPC-5 細(xì)胞培養(yǎng)48 h,將6孔板用PBS 洗滌2遍,胰酶消化后收集全部細(xì)胞,重懸細(xì)胞并加入膜聯(lián)蛋白(Annexin)V和碘化丙啶(PI)混勻,所有操作在冰上完成并避光孵育20 min,流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析〔10〕。

1.8Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 將各組細(xì)胞用RIPA蛋白裂解液冰上提取細(xì)胞總蛋白,冰浴30 min后,12 000 r/min 4 ℃ 離心10 min,取上清液測(cè)定蛋白濃度,加入上樣緩沖液,95 ℃金屬浴煮沸,12 000 r/min 4 ℃ 離心10 min,取上清液。將總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)80 V 15 min,120 V 2 h,與聚偏氟乙烯(PVDF)膜120 V 2.5 h轉(zhuǎn)膜,TBST漂洗3次,每次5 min,5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST漂洗3次,每次5 min,按照各抗體說(shuō)明對(duì)抗體進(jìn)行稀釋(1∶500～1∶5 000)加入一抗,4 ℃冰箱孵育過(guò)夜,TBST漂洗3次,每次5 min,羊抗兔二抗室溫孵育2 h,TBST漂洗3次,每次5 min,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色,發(fā)光儀曝光、拍照并進(jìn)行定量分析〔11〕。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)量顯著降低,并且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞CXCR3 mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.2si-CXCR3對(duì)腎足組細(xì)胞MPC-5細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組、si-CXCR3組腎足細(xì)胞活力顯著降低,并且隨著時(shí)間的增長(zhǎng),活力進(jìn)一步下降(P<0.05,P<0.01),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組腎足細(xì)胞活力顯著提升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3si-CXCR3對(duì)腎足細(xì)胞MPC-5細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組、si-CXCR3小鼠腎足細(xì)胞凋亡顯著增加(P<0.05,P<0.01),與模型組、si-NC組相比,si-CXCR3組小鼠腎足細(xì)胞凋亡顯著降低(P<0.01)。與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組、si-CXCR3組腎足細(xì)胞Bax和Caspase3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05,P<0.01),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組腎足細(xì)胞Bax和Caspase3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組腎足細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.4si-CXCR3對(duì)腎足組細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 與對(duì)照組相比,模型組、si-NC組、si-CXCR3組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,P<0.01);與模型組、si-NC組比較,si-CXCR3組上述指標(biāo)明顯降低,但仍顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 si-CXCR3對(duì)各組腎足組細(xì)胞炎癥因子分泌及自噬相關(guān)分析mRNA及蛋白表達(dá)、mTOR/S6K1信號(hào)通路的影響

2.5si-CXCR3對(duì)腎足組細(xì)胞自噬的影響 與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組Beclin1、ATG5和ATG7 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組、Beclin1、ATG5和ATG7 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.6si-CXCR3對(duì)腎足組細(xì)胞mTOR/S6K1信號(hào)通路的影響 與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組腎足細(xì)胞mTOR/S6K1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組mTOR/S6K1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與對(duì)照組相比,模型組和si-NC組腎足細(xì)胞S6K1蛋白磷酸化修飾顯著升高(P<0.05),與模型組和si-NC組相比,si-CXCR3組S6K1蛋白磷酸化修飾降低(P<0.05),并且與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討 論

糖尿病腎病是一種主要的長(zhǎng)期糖尿病微血管病變,可并發(fā)1型和2型糖尿病及其他繼發(fā)性糖尿病,包括移植后糖尿病。在糖尿病腎病的發(fā)展過(guò)程中,有3種主要的細(xì)胞內(nèi)代謝異常途徑:多元醇和PKC途徑的激活;晚期糖基化終產(chǎn)物的形成;腎小球?yàn)V過(guò)過(guò)度引起的腎小球內(nèi)高血壓。在這3條主要途徑的上游,高血糖是糖尿病腎病進(jìn)展為末期腎病(ESRD)的主要驅(qū)動(dòng)力,此過(guò)程中最好的預(yù)防策略是使用匹配良好的供體并進(jìn)行量身定制的免疫抑制(使用較少的致糖尿病藥物和可能的無(wú)類固醇方案)和生活方式的改變,嚴(yán)格的血糖控制,早期引入血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑及可能轉(zhuǎn)換為不致糖尿病的治療方案,有助于延緩糖尿病腎病的進(jìn)展〔12,13〕。

足細(xì)胞與腎病綜合征中的蛋白尿與腎小球的機(jī)械性功能障礙有關(guān),涉及足細(xì)胞上皮細(xì)胞的功能,包括足細(xì)胞足突的消失,因此腎小球足細(xì)胞是腎臟研究的重要靶點(diǎn)之一〔14〕。研究表明從多能干細(xì)胞中建立的腎臟類器官已經(jīng)能夠?qū)θ祟愖慵?xì)胞的發(fā)育和疾病進(jìn)行詳細(xì)的分析,類器官中的足細(xì)胞表達(dá)相關(guān)基因和蛋白質(zhì),并表現(xiàn)出特征性的形態(tài),尤其是在實(shí)驗(yàn)性移植中〔15〕。當(dāng)前有研究通過(guò)分析糖尿病及糖尿病合并早期腎損傷患者外周血清趨化因子CXCR3及其配體MIG,IP-10的表達(dá)水平,證實(shí)CXCR3,MIG,IP-10表達(dá)水平與糖尿病早期腎損傷發(fā)生具有一定的關(guān)系,可一定程度上反映2型糖尿病腎臟損傷的嚴(yán)重程度〔16〕,本研究提示,出沉默CXCR3可通過(guò)抑制炎癥因子釋放的途徑發(fā)揮腎足細(xì)胞的保護(hù)作用。

自噬是可清除蛋白質(zhì)聚集體和受損細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),是重要的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制,參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程,在糖尿病條件下失調(diào)的自噬可能導(dǎo)致腎小球和腎小管間質(zhì)病變〔17〕。本研究提示,出沉默CXCR3可以糾正失調(diào)的自噬,自噬是一種正常的生理過(guò)程,在體內(nèi)平衡和萎縮中較為活躍,由于本研究同時(shí)證實(shí)了沉默CXCR3后細(xì)胞凋亡水平顯著降低,這側(cè)面證實(shí)了凋亡傾向和自噬傾向之間的復(fù)雜調(diào)控關(guān)系,在特殊細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下自噬構(gòu)成了一種應(yīng)激適應(yīng),可以避免細(xì)胞死亡,并抑制凋亡,而在其他細(xì)胞環(huán)境中,自噬構(gòu)成了一種替代性細(xì)胞死亡途徑〔18〕。基于本研究對(duì)于凋亡和自噬的結(jié)果推測(cè)沉默CXCR3可以通過(guò)增強(qiáng)自噬作用清除細(xì)胞中受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,來(lái)促進(jìn)維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài),從而降低組細(xì)胞的損傷和凋亡。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)因子,mTOR通過(guò)多種信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,其信號(hào)通路在許多人類疾病中被解除調(diào)控〔19〕。mTOR在調(diào)節(jié)自噬中也起著重要作用,當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)急信號(hào)時(shí)誘導(dǎo)自噬消除了這些應(yīng)激引起的損傷,當(dāng)應(yīng)激解除時(shí),自噬恢復(fù)到正常水平,此過(guò)程伴隨著凋亡的增加和凋亡的減少,以及mTOR信號(hào)通路的調(diào)控〔20〕。本研究表明,高糖刺激后的小鼠腎足細(xì)胞MPC-5會(huì)出現(xiàn)顯著高表達(dá)mTOR和S6K1蛋白,因此可以顯著抑制自噬蛋白分子的表達(dá),從而抑制自噬,誘導(dǎo)凋亡,而沉默CXCR3可以下調(diào)mTOR及S6K1蛋白的表達(dá),從而糾正異常的自噬,增加自噬作用,清除細(xì)胞中受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器,從新恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),發(fā)揮對(duì)自噬的調(diào)控作用。同時(shí),此過(guò)程中伴隨著mTOR/S6K1信號(hào)通路的磷酸化修飾調(diào)控,高糖刺激后的小鼠腎足細(xì)胞MPC-5會(huì)出現(xiàn)顯著高表達(dá)磷酸化的S6K1蛋白,而沉默CXCR3后,這種磷酸化蛋白表達(dá)顯著降低。