沉默miR-135a-5p對宮頸癌細胞增殖、侵襲的影響及作用機制

王敏 羅菁 鄧晶 謝環 李曉蘭

(1武漢市第一醫院,湖北 武漢 430022;2宜昌市第二人民醫院(三峽大學第二人民醫院))

臨床上對于宮頸癌的判斷最早起源于20世紀65年代,其是女性泌尿、生殖系統常發的惡性腫瘤病癥,患者罹患宮頸癌后需及時重視起來,避免病癥惡化〔1〕。據某些研究報道〔2〕,現當下我國宮頸癌患者基數逐年升高,因此宮頸癌成了臨床婦科研究的重中之重。據某些研究認為〔3〕,患者在宮頸癌治療期間往往會存在不同程度適應不良等表現,可能會導致病情惡化狀況發生,進而影響治療結局。微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)在惡性腫瘤組織中呈高度表達,尤以宮頸癌最為明顯〔4〕。據某些研究報道〔5〕,miR-135a-5p是結構高度保守的蛋白質,在測驗宮頸癌過程中起到至關重要的作用,其亦可用來表達嚴重程度、TNM分期、腫瘤轉移狀況等宮頸癌臨床特征。本研究探討沉默miR-135a-5p對患者機體病灶組織內宮頸癌細胞增殖影響、侵襲效率,并研究其主要作用機制。

1 對象與方法

1.1材料 人宮頸癌HeLa細胞(購自上海信裕生物科技有限公司,貨號:HeLa,品牌:ATCC),本研究過程經醫院倫理委員會批準。RPMI 1640由(北京伊塔生物科技有限公司提供,貨號:YT8432;胎牛血清由廣州蕊特生物科技有限公司提供,貨號:S8056-00/01/05;miR-144基因由杭州開泰生物技術有限公司提供,貨號:CD201-0011;Trizol試劑由武漢純度生物科技有限公司提供,貨號:CD-102523GM;磷酸鹽緩沖液(PBS)由上海廣銳生物科技有限公司提供,貨號:PR694;磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抗體由深圳豪地華拓生物科技有限公司提供,貨號:PL0402037;蛋白激酶B(AKT)抗體由沈陽萬類生物科技有限公司提供,貨號:WL0003b。

1.2宮頸癌HeLa細胞培育和分組 先用雙抗的RPMI1640、13%胎牛血清完全培養基,保存溫度為38 ℃培養已購買的人宮頸癌HeLa細胞,每隔4 d替換新鮮培養液,當細胞融合度達到73%以上時,開始傳代培養。選擇人宮頸癌HeLa細胞,將其分為對照組、過表達組、沉默組。

1.3miR-135a-5p轉染實驗 對照組不做處理,過表達組轉染miR-135a-5p mimics上調載體,沉默組轉染miR-135a-5p inhibitor下調載體。miR-135a-5p mimics序列:上游引物5′-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3′,下游5′-AGACCGAGACAAGUGCAAUGUU-3′;miR-135a-5p inhibitor序列:上游引物5′-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3′,下游5′-AGGCCGGGACGAGUGCAAUAUU-3′,在轉染過程中,每組培養基濃度均保持在120 nmol/L。

1.4熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)實驗 于11時取出培育好的宮頸癌HeLa細胞樣本,實時RT-PCR法檢驗miR-135a-5p指標。選取轉染72 h對照組、過表達組、沉默組miR-135a-5p細胞,并用Trizol試劑提取,將采集到的總核糖核酸經逆轉錄合成cDNA,配制反應體系可選用各組2 μl的核糖核酸樣本,0.78 μl、1.23 μl、4.56 μl、0.27 μl的RT、dNTPs、5 ml緩沖液、逆轉錄酶(MMLV),保持15 ℃下,35 min。組建RT-PCR體系,其中包含1.33 μl、7.67 μl、1.2 μl、0.10 ml的無核酸酶水、cDNA、引物、探針混合物及通用混合物,小核RNA為內部。其中,miR-135a-5p序列:上游引物5′-GGGCGGAATTGCACTTGTC-3′,下游5′-CTCAACTGGTGGTGTCGT GGAGTC-3′,反應25 min,保持溫度在75 ℃,接著50 ℃下反應10 min,循環40次,記錄數值,即為miR-135a-5p表達量。

1.5四甲基偶氮唑鹽(MTT)實驗 宮頸癌HeLa細胞增殖能力檢測使用MTT法:將每個組胰酶進行分解,形成單細胞懸液,離心5 min,丟棄上清液,使用5 ℃的洗液,洗滌2次。取配制的單細胞懸液,加0.23 ml、0.50 ml的MTT、70%乙醇,在-24 ℃下固定,并在5 ℃下放置12 h,離心9 min,洗液洗滌3次,放于無光環境下,取用碘化丙啶液染色,用SpectraMax Paradigm卡盒式多功能酶標儀(美谷分子儀器有限公司 上海)檢測OD值,計算增殖能力指數。用Agilent NovoCyte 流式細胞儀(安捷倫科技公司 美國)檢測宮頸癌HeLa細胞的凋亡能力。

1.6劃痕實驗 劃痕實驗用來檢驗宮頸癌HeLa細胞遷移能力,選宮頸癌HeLa細胞用胰蛋白酶分解,獲取細胞懸液接種至6孔板上,并用0.014 ml移液器槍頭將全部單層細胞從上至下畫一條劃痕,用PBS洗滌刮下細胞,向干凈培養基中加4 ml溶液,37 ℃下培育29 h,棄去培養液,顯微鏡下觀察并記錄視野平均值,重復3次,取細胞遷移數平均值。

1.7Transwell小室實驗 使用Transwell小室檢驗各組宮頸癌HeLa細胞侵襲能力指數,于15時將培養板置于Transwell小室,下室加120 ng/ml反應溶液、上室加細胞液,靜放2 d,用三羥甲基丙烷溶液對培養板進行處理,PBS洗5次,每次洗5 min,固定并用蘇木素染色,洗滌后,在顯微鏡下,觀察上室的細胞數,記錄視野內細胞數平均值,重復4次,取宮頸癌HeLa細胞侵襲數平均值。

1.8統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行F檢驗。

2 結 果

2.1miR-135a-5p轉染效果驗證 與對照組比較,過表達組miR-135a-5p指標明顯升高,沉默組miR-135a-5p指標明顯降低,有統計學差異(P<0.05);與過表達組比較,沉默組miR-135a-5p指標明顯降低(P<0.05),說明miR-135a-5p轉染成功。見表1。

表1 沉默miR-135a-5p對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡能力的影響個)

2.2沉默miR-135a-5p對宮頸癌HeLa細胞增殖、凋亡的影響 與對照組比較,過表達組(24、48、72 h)宮頸癌HeLa細胞增殖能力明顯升高,凋亡能力明顯降低,沉默組(24、48、72 h)宮頸癌HeLa細胞增殖能力明顯降低、凋亡能力明顯升高(P<0.05);與過表達組比較,沉默組(24、48、72 h)宮頸癌HeLa細胞增殖能力明顯降低、凋亡能力明顯升高(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組宮頸癌HeLa細胞增殖能力MMT實驗(碘化丙啶染色,×200)

2.3沉默miR-135a-5p對宮頸癌HeLa細胞遷移的影響 與對照組比較,過表達組宮頸癌HeLa細胞遷移數明顯較多,沉默組宮頸癌HeLa細胞遷移數明顯較少(P<0.05);與過表達組比較,沉默組宮頸癌HeLa細胞遷移數明顯較少(P<0.05);與對照組〔(75.21±8.11)%〕比較,過表達組宮頸癌HeLa細胞劃痕愈合率〔(102.67±5.43)%〕明顯較高,沉默組宮頸癌HeLa細胞劃痕愈合率〔(62.31±5.48)%〕明顯較低,與過表達組比較,沉默組宮頸癌HeLa細胞劃痕愈合率明顯較低(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組宮頸癌HeLa細胞遷移能力劃痕實驗(×100)

2.4沉默miR-135a-5p對宮頸癌HeLa細胞侵襲的影響 與對照組比較,過表達組宮頸癌HeLa細胞侵襲數明顯較多、沉默組宮頸癌HeLa細胞侵襲數明顯較少(P<0.05);與過表達組比較,沉默組宮頸癌HeLa細胞侵襲數明顯較少(P<0.05)。見表1、圖3。

3 討 論

雖然預防宮頸癌的手段技術在不斷提高,宮頸癌的診治方案也在不斷改善,可其對病患造成的病痛傷害是不可逆的〔6～9〕。宮頸癌特點是女性宮頸出現惡性腫瘤,其早期癥狀不明顯,隨著腫瘤增大從而引發并發癥,進而影響宮頸癌病情。據某些研究報道〔10,11〕,宮頸癌通過血液循環擴散至患者機體其他臟器,進而加重病情,產生其他臟器并發癥。據某些研究認為〔12〕,罹患宮頸癌與多種因素共同作用相關。

據某些研究報道〔13～15〕,miR-135a-5p在宮頸癌HeLa細胞中是一種多功能基因蛋白,在腫瘤治療抵抗中具有重要警示作用,miR-135a-5p又包含多個子蛋白因子,其具有兩個相對獨立的功能域:N端的redox功能域、C端的DNA修復功能域。miR-135a-5p其內核心基因AP核酸內切酶活性是促進宮頸癌HeLa細胞增殖不可或缺的因子,且miR-135a-5p提供宮頸癌HeLa細胞內95%AP內切酶活性,亦就是表明miR-135a-5p造成宮頸癌HeLa細胞增殖,故其在宮頸癌機體中異常表達〔16～18〕。有研究認為〔19～21〕,miR-135a-5p基因可以和機體大約1/4微小RNA引起共鳴,其中miR-135a-5p在宮頸癌等病癥中呈現高度異常,同時與宮頸癌HeLa細胞的出現有著密切聯系。miR-135a-5p參與宮頸癌HeLa細胞增殖、侵襲過程,通過沉默miR-135a-5p亦可改變宮頸癌HeLa細胞遷移速度、侵襲效率,進而影響宮頸癌病灶組織病理反應。由此結果本研究推測,沉默miR-135a-5p可改變宮頸癌HeLa細胞基質的生物活性,此結果顯示,當沉默miR-135a-5p表達量時,宮頸癌HeLa細胞的感染能力將會大幅度降低,緩解患者病情。

綜上,miR-135a-5p與宮頸癌具有相關聯系,檢測miR-135a-5p表達對宮頸癌具有一定診斷效能,從而改變宮頸癌的治療效率,miR-135a-5p為治療宮頸癌提供借鑒指導,在宮頸癌治療上值得探討,miR-135a-5p對宮頸癌具有重要意義。