歸脾湯對慢性疲勞綜合征小鼠認知能力及炎癥因子的影響

陳文鈺 陳言 司國瑞 李曉龍 段萌媛 鄧鑫鑫 戶慶慶 陳俊儒 孟欣 黃克杰 平靜濤 王鵬禹 馬夢舸 李曉冰

(河南中醫藥大學醫學院,河南 鄭州 450008)

慢性疲勞綜合征(CFS)是一種復雜的、使人衰弱的疾病,其特征是極度疲勞,不因休息而改善。CFS通常與焦慮、抑郁、神經內分泌異常及各種軀體疾病相關,特征不僅為嚴重疲勞,還常伴有神經內分泌、認知和免疫功能損傷〔1〕。研究發現,CFS患者外周血炎癥因子水平較健康人明顯升高〔2〕,提示CFS可能通過影響免疫系統從而導致機體微炎癥狀態〔3〕?，F代醫學對該病缺乏特異診斷標準和有效治療方案。歸脾湯始載于宋代《濟生方》,是祖國醫學經典名方,具有益氣補血、健脾養心等功效。臨床觀察發現,歸脾湯能顯著消除患者疲勞感,對CFS療效確切,臨床應用廣泛〔4〕。本研究立足中醫傳統理論,選取臨床療效確切的歸脾湯對CFS小鼠模型進行干預,從炎癥角度探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔健康 SPF級雄性小鼠30只,6～8周齡,體質量18～22 g,生產許可證號:SCXK-(豫)2019-0002。實驗動物的飼養管理和實驗操作過程均遵守河南中醫藥大學實驗室相關規定。

1.2藥物與試劑 歸脾湯(藥用白術30 g、人參15 g、黃芪30 g、當歸15 g、炙甘草8 g、茯神30 g、遠志15 g、酸棗仁30 g、木香15 g、龍眼肉30 g)購自河南張仲景大藥房。乳酸試劑盒、白細胞介素(IL)-1測定試劑盒、腫瘤壞死因子(TNF)-α測定試劑盒均購自南京建成生物研究所。

1.3主要儀器 全自動酶標儀(美國Bio-tek公司);電熱恒溫培養箱(廣州市康恒儀器有限公司);精密天平(上海奔普科技儀器有限公司);高速離心機(貝克曼庫爾特公司);曠場箱、SA101B 動物跑臺(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)。

1.4實驗分組 將小鼠隨機分成5組,即正常組、模型組、歸脾湯低劑量(GPT-L)組、歸脾湯中劑量(GPT-M)組、歸脾湯高劑量(GPT-H)組。

1.5造模及給藥 采用跑臺式疲勞方法制備CFS小鼠模型〔5〕。除正常組外其余4組進入動物跑臺造模4 w。第1周將每只小鼠放在速度為10 m/min的跑臺上運動30 min。在第2、3周和第4周,運行輪的速度逐漸增加到12 m/min,13 m/min和17 m/min,持續時間從第3周延長到60 min。如小鼠疲勞,不愿繼續運動,將從跑臺前方滑入邊緣觸電網,迫使其必須繼續運動,以避免電擊。每周小鼠運行5 d休息2 d。造模后,GPT-L、GPT-M、GPT-H組按照3、6、12 g/(kg·d)劑量灌胃,連續2 w。

1.6取材 稱量小鼠體質量,取小鼠外周血。取腎臟、肝臟稱重并冰上勻漿。

1.7生化法檢測血清乳酸水平 采用1.6中所得外周血,以3 000 r/min離心15 min后取上清,嚴格按試劑說明書測定血清乳酸水平。

1.8力竭游泳實驗 將小鼠尾部固定一約為體質量5%的夾子,置入深為20 cm、水溫20～25 ℃的游泳池內,記錄小鼠從入水到力竭的時間。

1.9懸尾實驗 將小鼠尾端1 cm部分固定于不銹鋼板上,板面距離地面1 m左右,使小鼠呈倒掛狀,觀察5 min內的掙扎次數及不動時間。

1.10曠場實驗 曠場實驗箱底部為50 cm×50 cm×50 cm的正方形開闊地,被劃分為25個黑線網格,中心9個網格被定義為中心區域。將動物放中心格中探索5 min,自動記錄動物越過黑線次數(水平得分)、表現出豎立行為的次數(垂直得分)及平均速度。每次實驗之間用75%乙醇清洗場地。

1.11Morris水迷宮實驗 將圓形水箱分為4個象限,在水箱內部每個象限處貼上4個不同形狀、不同顏色的標記物(標記物之間距離相等),將平臺放在第四象限中間固定不動。定位航行實驗:水箱溫度為19～22 ℃,水的高度超過平臺1 cm,將小鼠置于象限中央頭朝平臺內壁方向,當小鼠找到平臺并在上面停留5 s,實驗結束取出小鼠擦干,放進鼠籠。若小鼠1 min時未找到平臺,則實驗自動結束,需人工引導其到平臺上,停留10 s取出。最后一次檢測時不需引導,撤掉平臺,時間限定1 min。觀察1 min內潛伏期及運動總距離?？臻g探索試驗:定位航行試驗結束后,撤除平臺。任選一相同入水點將小鼠放入水中,觀察受試鼠的空間定位能力及在空間探索過程中的變化規律,記錄小鼠平均速度及平臺區域運動距離。

1.12酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α 采用ELISA法嚴格按照說明書操作檢測血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.13統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析。兩兩比較符合方差齊用LSD,不符合方差齊用塔姆黑尼或鄧尼特。

2 結 果

2.1歸脾湯對CFS血清乳酸水平、力竭游泳時間及懸尾實驗影響 與正常組比較,模型組血清乳酸水平和懸尾靜止時間明顯升高、力竭時間和懸尾掙扎次數明顯降低(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,GPT-M、GPM-G組血清乳酸水平顯著降低、懸尾掙扎次數明顯升高(P<0.05,P<0.01),GPT各組懸尾靜止時間明顯減少、力竭時間明顯延長(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 歸脾湯對CFS血清乳酸水平、力竭游泳時間、懸尾實驗及曠場實驗影響

2.2歸脾湯對CFS曠場實驗影響 與正常組比較,模型組平均速度、水平得分及垂直得分明顯降低(P<0.01);與模型組比較,GPT各組平均速度、GPT-L、GPM-G組水平得分及垂直得分明顯增加(P<0.05,P<0.01),見表1。

2.3歸脾湯對CFS小鼠Morris水迷宮實驗影響 與正常組比較,模型組定向巡航實驗中逃避潛伏期、運動總距離顯著提高,空間探索實驗中平均速度、平臺區運動距離明顯縮短(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,CPT各組逃避潛伏期、運動總距離明顯縮短,平均速度、平臺區運動距離明顯增加(P<0.05,P<0.01),見表2。

表2 歸脾湯對CFS小鼠Morris水迷宮實驗影響

2.4歸脾湯對CFS外周血炎癥因子影響 與正常組比較,模型組血清IL-1、IL-6及TNF-α濃度明顯升高(P<0.01);與模型組比較,CPT各組IL-1、IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.01),見表2。

3 討 論

CFS特征在于身體長期無法休息從而導致的嚴重疲勞狀態。CFS多伴有不同程度中樞神經受損改變,如失眠、記憶力和注意力減退等精神認知功能障礙表現〔6〕。認知功能障礙是CFS的重要組成部分,主要影響執行功能,表現為注意力無法集中、信息處理速度變慢等。中醫將CFS歸為虛勞,認為脾虛是CFS發生的根本病機〔7〕,脾主生清,若脾氣虛弱不能升清,上不得精微之滋養則九竅不通,腦失所養,而見頭目眩暈,精神疲憊,記憶力減退〔8〕,其表現與CFS認知功能障礙相似。

本實驗通過檢測力竭游泳、懸尾實驗、血清乳酸水平評價小鼠疲勞狀態。力竭游泳實驗是判斷疲勞程度的經典行為學實驗〔9〕,懸尾實驗靜止時間和掙扎次數反映小鼠體力變化〔10〕。血乳酸是缺氧狀態下糖代謝產物,劇烈運動時體內乳酸升高,血乳酸水平可用來評定機體疲勞狀態〔11〕。本實驗提示,疲勞模型制備成功。曠場實驗利用小鼠懼怕空曠、趨向探索陌生環境的天性,通過記錄小鼠活動狀態評估其自主探究行為〔12〕。Morris水迷宮實驗反映小鼠空間記憶等認知能力〔13〕。本實驗通過以上行為學實驗綜合評價小鼠認知能力,結果提示,歸脾湯能影響CFS模型小鼠自主探究行為,提高小鼠空間記憶等認知能力。

CFS患者外周血IL-6、TNF-α及IL-1β水平顯著升高,可加劇下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂,導致注意力下降、抑郁等中樞神經系統表現。近期研究發現IL-1和IL-6憑借與TNF-α相似的機制活化腦內的小膠質細胞和星形膠質細胞,使其進一步分泌 IL-1 和 IL-6,導致神經炎癥,引發認知和記憶損傷,提示IL-6、TNF-α及IL-1β的持續存在可能與CFS認知障礙密切相關〔3,14〕。本結果提示,歸脾湯對CFS模型小鼠炎癥細胞因子有一定調節作用。