雷公藤紅素聯合槲皮素體外抗癌增效作用

張月月 王君明,2 崔瑛

(1河南中醫藥大學藥學院,河南 鄭州 450046;2呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心)

雷公藤紅素為衛矛科雷公藤屬及南蛇藤屬植物(如雷公藤、南蛇藤、昆明山海棠)中所含的一個重要的三萜類化合物〔1,2〕,具有抑制肺癌、食管癌、乳腺癌等廣譜抗癌活性〔3～5〕。槲皮素為金錢草、枸杞子、菟絲子、淫羊藿等中藥所含的一個重要黃酮類化合物〔6～10〕,具有保肝、保腎、改善前列腺炎等廣泛的生物活性〔11～14〕。同時含有雷公藤紅素與槲皮素這兩個單體物質可共見于一些臨床制劑如昆仙膠囊〔15〕(主要由昆明山海棠、枸杞子、菟絲子、淫羊藿組成),也可見于減毒增效的現代研究如復方雷公藤湯〔16〕(含雷公藤與金錢草)。本文前期已證實了含有這兩個單體成分的雷公藤與金錢草飲片配伍對高危害性的肺癌、食管癌均有抗癌增效作用〔17,18〕。本研究首次從成分配伍層面,考察雷公藤紅素聯合槲皮素對肺癌和食管癌的抗癌增效作用,為雷公藤紅素與槲皮素的科學合理聯用提供初步的臨床前實驗證據。

1 材料與方法

1.1細胞株 人肺癌細胞株A549、食管癌細胞株Eca9706均由河南中醫學院分子生物學實驗中心提供。

1.2主要試藥 雷公藤紅素購于上海金穗生物科技有限公司,純度≥98%(HPLC),批號:131106;槲皮素購于上海金穗生物科技有限公司,純度≥98%(HPLC),批號:K121228。RPMI1640(Gibco公司);胎牛血清(HyClone公司);四甲基偶氮唑藍(MTT,Amresco公司);二甲基亞砜(DMSO,Amresco公司);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(0.25%)含酚紅(Solarbio公司)。

1.3主要儀器 酶標儀(BioTek ELx800uv);紫外分光光度計(BioMate);Heraeus細胞培養箱(德國Kendro);倒置顯微鏡(ZESS);SG-603生物安全柜(Bake);Milli-Q Advantage A10型超純水機(Millipore);3-18K高速冷凍離心機(Sigma);TDL-40B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);XK96-B渦流混合器(姜堰市新康醫療器械有限公司);BS210S型電子天平(北京塞多利斯天平有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);HH6數顯恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)。

1.4細胞培養 細胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中,置于37 ℃、5% CO2培養箱,每間隔48 h更 換1次培養基,實驗時細胞用消化液(0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶以1∶1比例配制)進行消化,并接種于96孔板中。

1.5MTT法測定細胞增殖抑制率 細胞以1×104/孔接種96孔培養板,于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h。設對照組、不同濃度雷公藤紅素(0.25、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L)組及不同濃度雷公藤紅素與槲皮素配伍組。參考研究〔19〕,槲皮素對A549、Eca9706細胞的IC30值分別為82.7、104.8 μmol/L。每組3個復孔,繼續培養48 h,去除培養上清,每孔加入0.5 mg/ml的MTT 100 μl,繼續培養4 h,小心吸去上清,并加入150 μl DMSO溶解紫色沉淀,用酶標儀在波長為570 nm/630 nm,測定光密度D(λ)值。抑制率(%)=〔1-D(λ)實驗孔/ D(λ)對照孔〕× 100。

1.6統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析、t檢驗并計算半數抑制濃度(IC50)和30%抑制濃度(IC30)。

2 結 果

2.1雷公藤紅素及其配伍槲皮素抑制A549、Eca9706細胞增殖 雷公藤紅素濃度1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L時對人肺癌A549及濃度2.50、5.00、10.00、20.00 μmol/L時對人食管癌Eca9706細胞增殖均有顯著抑制作用(P<0.05,P<0.01),且呈劑量依賴性。配伍IC30槲皮素后,雷公藤紅素在0.25、1.25 μmol/L使人肺癌A549細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.01),而在其他更高濃度時,配伍槲皮素后抑制率均無顯著差異(P>0.05);配伍IC30槲皮素后,雷公藤紅素在0.25、1.25及2.50 μmol/L時,人食管癌Eca9706細胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.01,P<0.05),而在其他更高濃度時,配伍槲皮素后抑制率均無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 雷公藤紅素對人肺癌A549細胞、食管癌Eca9706細胞增殖抑制率的量效關系及配伍槲皮素前后兩種癌細胞增殖抑制率的比較

2.2雷公藤紅素配伍槲皮素前后細胞的IC30、IC50值 雷公藤紅素對A549、Eca9706細胞的IC50為4.687、4.939 μmol/L,IC30為1.774、1.989 μmol/L;配伍IC30槲皮素后,雷公藤紅素對A549、Eca9706細胞的IC50分別降低至2.064、2.040 μmol/L,IC30分別降低至0.337、0.408 μmol/L。表明配伍槲皮素對雷公藤紅素的抗癌藥效起到了協同增效作用。

3 討 論

以雷公藤紅素為重要活性成分的中藥(如昆明山海棠、雷公藤)和以槲皮素為重要活性成分的中藥(如枸杞子、菟絲子、淫羊藿、金錢草)配伍,?？山M方昆仙膠囊〔15〕(主要由昆明山海棠、枸杞子、菟絲子、淫羊藿組成)、復方雷公藤湯〔16〕(含雷公藤與金錢草)應用。本文之前的研究已經從飲片配伍層面證實雷公藤與金錢草配伍對人肺癌A549和食管癌Eca9706細胞增殖具有抗癌增效作用〔17,18〕。MTT法是體外生物活性評價最常用的研究方法之一,已被廣泛應用于抗腫瘤等多種生物活性的研究和評價,尤其適合于對單體成分活性的評價〔18～21〕。本研究結果表明,配伍槲皮素對雷公藤紅素對人肺癌A549及食管癌Eca9706細胞具有明顯的抗癌協同增效作用且雷公藤紅素的抗癌增效作用呈現出一定的量效關系。進一步從體內實驗層面考察雷公藤紅素配伍槲皮素的抗癌增效作用及其機制,將是后續研究的重要方向。