p16、PADI4在食管癌組織中表達及其與放射治療后預后的相關性

劉艷嬌 張倩 何龍英 張興隆

(邯鄲市第一醫院,河北 邯鄲 056002)

食管癌死亡率高居全球第6,在我國,食管癌發病率居于所有惡性腫瘤的第5位〔1,2〕。目前臨床上對于食管癌的治療方法包括采用外科手術、內鏡、化療及放化療等,手術治療時首選方法,但是治療效果較差,主要是應為腫瘤的局部復發及遠處轉移,且術后患者機體免疫能力降低〔3,4〕。p16是繼p53后近年來發現的又一個抑癌基因,又稱為多腫瘤抑制基因,可對細胞周期進行調控,是cyclin-CDK復合物的特異性抑制劑〔5〕。肽酰基精氨酸脫亞胺酶(PADI)4屬于表觀遺傳調控因子,研究發現其在惡性腫瘤患者血漿中表達水平增加,且對抑癌基因p53調控的下游基因具有抑制作用,從而破壞細胞增殖和凋亡,有可能是腫瘤易感基因,但是其在食管癌中的作用尚未有報道〔6,7〕。本研究探討p16、PADI4在食管癌組織中的表達及其與放射治療后預后的相關性。

1 資料與方法

1.1基本資料 選取58例邯鄲市第一醫院于2016年12月至2017年8月收治的接受放射治療的食管癌患者,男33例,女25例,平均年齡(59.03±8.33)歲。病變長度:10例>5 cm,33例3～5 cm,15例<3 cm。TNM分期〔8〕:Ⅰ～Ⅱ期38例,Ⅲ～Ⅳ期20例。食管鱗癌樣本離體30 min內,迅速切取食管鱗癌組織和配對的癌旁正常組織(距病變部5～10 cm以上),放入提前加入RNA保護液的凍存管中并標記臨床病理信息,置入-80 ℃冰箱中冷凍保存。

1.2p16和PADI4表達水平的測定 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法進行測定。將組織置于液氮中充分研磨后,用TRIzol法提取組織細胞中總的RNA,參照TaKaRa試劑盒說明書進行反轉錄,并對p16和PADI4(大連寶生物公司) 進行擴增。以GAPDH(大連寶生物公司)為內參,p16、PADI4及GAPDH引物序列如下:p16上游引物:5′-TGGCTCTGACCATTCTGT-3′,下游:5′-AGCTTTGGA AGCTCTCAG-3′,產物長度522 bp;PADI4上游引物:5′-GGTGTACGCGTGCAGTATTT-3′,下游:5′-TT CATCCTGCATCCACTGGT-3′,產物長度133 bp;GAPDH上游引物:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′,產物長度452 bp。PCR條件為:95 ℃ 10 s,60 ℃ 32 s,進行40個循環。采用相對定量法對qRT-PCR的結果進行計算,相對表達量的計算公式=2-ΔΔCt。

1.3放療方法 采用三維適形放療。采用螺旋CT對全部食管進行連續掃描,根據食管鏡、食管造影和CT勾畫出靶區GTV,并左右外擴5～10 mm、上下外擴30 mm,形成CTV,同時對心臟、肺和脊髓進行勾畫。照射劑量為50～66 Gy,每次2 Gy,5次/w,并進行5～6 w。雙肺V20>25%,心臟V40<45%,脊髓>45 Gy。

1.4臨床療效評估標準〔9〕所有靶病灶均無動脈期增強表示完全緩解(CR);靶病灶增強掃描動脈期的直徑總和≥30%表示部分緩解(PR);靶病灶增強掃描動脈期直徑增加≥20%表示疾病進展(PD),靶病灶增大程度未達到PD標準,靶病灶縮小程度未達到PR標準表示疾病穩定(SD)。腫瘤體積無縮小或有新的病灶出現表示無效(NC)。

1.5統計學方法 采用 SPSS22.0軟件進行t檢驗、F檢驗、χ2檢驗、Pearson相關系數法、K-M生存函數分析。

2 結 果

2.1癌組織和癌旁組織中p16和PADI4的表達水平比較 與癌旁組織相比,癌組織中p16表達水平明顯較低,癌組織中PADI4表達水平明顯較高(均P<0.001)。癌組織中p16表達水平與PADI4表達水平呈負相關(r=-0.874,P<0.001)。見表1。

表1 癌組織和癌旁組織中p16和PADI4表達水平比較

2.2放療不同敏感性患者癌組織中p16和PADI4表達水平比較 58例食管癌患者放射治療后,21例患者CR,33例患者PR,4例患者NC。放療不同敏感性患者癌組織中p16和PADI4表達水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)。CR組癌組織中p16表達水平顯著高于CR組和NC組(P<0.05),PR組癌組織中p16表達水平顯著高于NC組(P<0.05)。CR組癌組織中PADI4表達水平顯著低于PR和NC組(P<0.05),PR組癌組織中PADI4表達水平顯著低于NC(P<0.05)。見表2。

表2 放療不同敏感性患者癌組織中p16和PADI4表達水平

2.3p16和PADI4表達水平與患者臨床病理特征相關性分析 食管癌患者癌組織中p16和PADI4表達水平與TNM分期、浸潤程度及淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。見表3。

表3 p16和PADI4表達水平與食管癌患者臨床病理特征相關性

2.4p16和PADI4表達水平與放射治療后預后的關系 對58例食管癌患者隨訪3年,死亡28例,存活30例,3年生存率為51.72%。其中 p16高表達組3年存活率為62.86%,p16低表達組3年存活率為34.78%,差異有統計學意義(χ2=4.381,P=0.036)。PADI4高表達和低表達組3年生存率分別為35.71%和66.67%,差異顯著(χ2=5.557,P=0.001 8)。生存曲線見圖1。

圖1 放療后食管癌患者K-M生存曲線

3 討 論

近年來我國食管癌的發病率逐年增加,是惡性度最高的惡性腫瘤之一,具有較強的侵襲性,即使根除后仍具有較高的復發率,5年的生存率僅為15%～20%,造成食管癌治療失敗的主要原因是抗敏感性細胞進展和遠處轉移及對放療敏感性較差〔10,11〕。

P16的構成含有148個氨基酸,是近年來發現的又一個抑癌基因,位于9號染色體,其編碼的產物是含有4個獨特的錨蛋白重復結構〔12〕。在腫瘤的發展過程中會使p16發生突變、甲基化及缺失,致使其失去活性,進而引起腫瘤發生〔13〕。Mathew等〔14〕研究結果顯示,p16的缺失與遠處器官轉移及食管癌的病理分期具有一定的相關性。本研究發現,提示p16表達水平可能與食管癌惡性程度有關。

PADI4屬于表觀遺傳調控因子,表觀遺傳調控因子廣義上講包括組蛋白修飾酶或去修飾酶,DNA甲基化酶,新出現的非編碼RNA及識別修飾的識別子,大量研究證實他們在惡性腫瘤的發生發展中具有重要的參與作用〔15,16〕。癌癥的基本機制即是由表觀遺傳調節因子異常改變造成的表觀遺傳基因組的破壞,因此表觀遺傳調控是腫瘤生物學研究的重要熱點〔17,18〕。表觀遺傳因子可通過對靶基因的表達促進或抑制而影響腫瘤發生發展的生物標志物的表達如會造成其分化阻滯、惡性自我更新、組織侵襲及逃避細胞死亡等〔19〕。以往研究發現,PADI4在前列腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、乳腺癌及十二指腸癌等多種癌癥的發生發展過程中都有參與,且PADI4與食管鱗癌的病理分期具有相關性〔20,21〕。P53是一種抑癌基因,可對靶基因的轉錄進行調控進而對細胞的惡性轉化起到抑制作用,調控細胞周期和凋亡。已有研究報道PADI4對p53的下游基因p21、WAF1等基因具有抑制作用,從而擾亂細胞凋亡和細胞周期,說明PADI4在惡性腫瘤的發病過程中具有非常重要的作用〔22,23〕。

本研究結果提示,p16和PADI4在食管癌的發生發展過程中可能具有協同作用,共同參與食管癌的發生發展過程。