不同嚴重程度肺炎支原體肺炎患兒肺部NLRP3信號通路的變化及其臨床價值*

彭力，鐘禮立，黃寒，林琳，丁小芳，陳敏，林小娟

[湖南師范大學附屬第一醫院（湖南省人民醫院） 兒童呼吸病學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410005]

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae,MP）是社區獲得性肺炎常見致病菌之一[1]，主要致病機制包括直接感染、間接感染和免疫損傷[2]。近年來重癥或難治性兒童肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）患兒較多，病死率可達3%～5%[3]，然而該病發病機制目前仍未完全闡明[4]。

自噬是人類進行穩態維持的一種機制，將胞內損傷的蛋白質、細胞器及侵入病原菌經溶酶體進行降解，具有抵抗病原菌作用[5]。近來研究顯示MP侵入呼吸道上皮細胞后可引發機體自噬，但目前自噬相關信號通路在兒童MPP研究較少。基于此，本研究回顧性分析湖南省人民醫院MPP患兒臨床資料，評估NOD樣受體蛋白3（NOD like receptor protein 3,NLRP3）信號通路相關蛋白在不同嚴重程度MPP中的變化，為MPP發病機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年4月—2022年10月湖南省人民醫院兒童醫學中心住院，行纖維支氣管鏡肺泡灌洗治療的90例MPP患兒作為MPP組。其中男性50例，女性40例；年齡2～11歲，平均（5.6±2.1）歲。MPP符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識（2015年版）》[6]診斷標準，即臨床表現和影像學具有肺炎改變，結合病原學檢查考慮MP急性感染：MP-免疫球蛋白（Immunoglobulin M,IgM）≥ 1∶160，或雙份血清（間隔2周）恢復期抗體滴度上升4倍或下降至原來的1/4，或MP-DNA陽性。根據病情將90例經纖支鏡肺泡灌洗的MPP患兒分為輕度組和重度組，在診斷MPP基礎上，至少存在以下特征之一為重度組：拒食或有脫水征；意識障礙；呼吸頻率增快（根據不同年齡判定）；紫紺；呼吸困難（呻吟、鼻翼扇動或三凹征）；多肺葉或≥ 2/3肺受累；胸腔積液；脈搏血氧飽和度≤ 0.92；合并肺外并發癥等[7]。其余患兒作為輕度組。輕度組患兒26例，其中男性17例，女性9例。重度組患兒64例，其中男性33例，女性31例。選取同期本院行異物取出術后復查的10例兒童作為對照組，其中男性5例，女性5例，無發熱、明顯咳嗽等臨床癥狀，無肺外并發癥等情況。

1.2 方法

回顧性分析MPP患兒性別、年齡、住院時間等基本資料，以及住院后的臨床資料和實驗室檢查指標[白細胞計數（white blood cell count,WBC）、血小板計數（platelet count,PLT）、降鈣素原（Procaicltonin,PCT）、C反應蛋白（C-reactive protein,CRP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）、丙氨酸轉移酶（alanine transaminase,ALT）、IgA、IgG、IgM、D二聚體]、MP拷貝數及肺外并發癥。患兒均于入院24 h內留取支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）標本，采用熒光定量聚合酶鏈反應行MP-DNA檢測，采用酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）檢測受試者BALF標本自噬相關蛋白微管相關蛋白1A/1B輕鏈3B（microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B,MAP1LC3B）、核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）和NLRP3水平。操作方法嚴格按照產品說明書進行，批內及批間分析變異系數分別＜ 10%，所有樣本設3個復孔。取對照組的肺泡灌洗液標本行MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3水平檢測。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過（No：2023-17）。

1.3 MPP患兒獲取纖維支氣管鏡肺泡灌洗液步驟

纖維支氣管鏡先端插入病變管嵌入管腔內（灌洗部位多選擇病變嚴重肺段，病變范圍比較廣泛者則選右肺中葉，小嬰兒選擇右下葉），以37 ℃生理鹽水（體重＜ 20 kg者，每次灌洗量1 mL/kg，體重≥ 20 kg者，每次灌洗量20 mL/kg）進行支氣管肺泡灌洗3次。隨即以負壓13.3～20 kPa（100～150 mmHg）進行抽吸以獲取灌洗液標本，置入滅菌痰液收集器。回收率＞ 40%、無大氣道分泌物混入，紅細胞＜ 20%視為合格標本。及時處理標本后置于-80 ℃冰箱冷凍保存以備檢查。

1.4 MPP患兒行纖維支氣管鏡檢查的指征

1.4.1 適應證 胸部X射線或CT檢查示肺不張或含氣不良，或符合難治性MPP診斷標準[6]的患兒。

1.4.2 禁忌證 嚴重心肺功能減退、心律失常、活動性大咯血，嚴重的出血性疾病、凝血功能損傷、嚴重的肺動脈高壓及其他可能誘發大咯血的疾病，嚴重營養不良，不能耐受手術等均為相對禁忌證。發熱患兒行纖維支氣管鏡術前需將體溫降至38 ℃以下。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）或中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，比較用t檢驗或秩和檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Spearman法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MPP組與對照組MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3水平比較

MPP組與對照組MAP1LC3B、NF-κB和NLRP水平比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），對照組低于MPP組。見表1。

表1 MPP組與對照組MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3水平比較 （x±s）

2.2 輕度組與重度組臨床資料比較

輕度組與重度組性別構成、發病年齡、WBC、PLT、PCT、ALT、IgG、IgM、MP拷貝數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。輕度組與重度組發熱時間、住院時間、影像學肺實變、肺外并發癥、胸腔積液、CRP、LDH、D二聚體、IgA、MAP1LC3B、NF-κB、NLRP3表達量比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；重度組發熱時間和住院時間較輕度組長，CRP、LDH、D二聚體、IgA、MAP1LC3B、NF-κB和NLRP3表達量較輕度組高。見表2。

表2 輕度組與重度組臨床資料比較

2.3 MAP1LC3B與NF-KB、NLRP3水平的相關性分析

Spearman相關性分析顯示，MAP1LC3B與NFκB水平（rs=0.510，P=0.020）、NLRP3 水平（rs=0.610，P=0.006）均呈正相關。見圖1、2。

圖1 MAP1LC3B與NF-KB水平的相關性分析

圖2 MAP1LC3B與NLRP3水平的相關性分析

3 討論

本研究結果提示，MPP重度組熱程較輕度組長，說明患兒炎癥持續存在，未得到有效控制，而高炎癥反應狀態下會導致機體出現持續高熱的狀況，最終導致疾病進展[8]。本研究結果發現，重度組CRP、LDH表達量較輕度組高。CRP、LDH均為炎癥指標[9]，在重度組明顯升高表明該組患兒感染MP后發生更強烈的炎癥反應。本研究結果還顯示，重度組D二聚體平均水平高于輕度組,與既往研究一致[10]。另外，IgA水平在重度組較輕度組明顯升高，可能與重度發生更為強烈的免疫反應有關。

MP與自噬相關。目前最新研究發現，肺炎支原體可通過Toll樣受體4和自噬依賴的途徑誘導小鼠巨噬細胞產生炎癥反應[11]。肺炎支原體社區獲得性呼吸窘迫綜合征毒素也可激活NLRP3炎癥小體，誘導THP-1細胞自噬[12]。另有雞毒支原體可能通過Toll樣受體2激活NF-κB信號通路誘導巨噬細胞自噬[11,13]。另有研究發現，綿羊肺炎支原體可誘導肺臟上皮細胞和巨噬細胞自噬[12]。MAP1LC3B參與自噬體形成，是自噬信號通路中不可缺少的蛋白之一，是判斷反應機體自噬嚴重程度的重要指標[14]。本研究結果顯示，MPP組MAP1LC3B水平較對照組顯著升高，且重度組MAP1LC3B水平較輕度組高，表明自噬參與MPP發病，且與MPP嚴重程度相關，與文獻研究顯示自噬相關蛋白與疾病嚴重程度相關結論一致[15]。

NLRP3炎癥小體是目前研究最廣泛、最明確的一種炎癥反應關鍵的調控點，且與肺部感染疾病關系密切[16]。報道表明在呼吸機相關肺損傷中，肺泡巨噬細胞中自噬的激活通過NLRP3炎癥小體信號傳導介導了機械通氣期間的早期肺部炎癥[17]。自噬還可以直接調節核轉錄因子NF-κB，從而調控相關炎癥反應[13]，而NF-κB通路激活NLRP3炎癥小體[18]。因此筆者推測，自噬通過調節NF-κB介導了NLRP3炎癥小體的激活，參與支原體肺炎的炎癥反應的發生。本研究結果發現，MPP組NF-κB、NLRP3表達量較對照組高，重度組NF-κB、NLRP3水平較輕度組高，進一步相關性分析提示MAP1LC3B與NF-κB、NLRP3呈正相關，提示自噬-NLRP3信號通路相關蛋白及細胞因子參與MPP的致病機制，且與疾病嚴重程度相關，臨床中在疾病早期通過對自噬-NLRP3信號通路相關蛋白及細胞因子檢測可為MPP的病情預測提供依據。

綜上所述，自噬-NLRP3通路信號參與MPP的發生、發展，以自噬-NLRP3通路作為調控MPP炎癥反應的靶點，以期為肺炎支原體感染所致肺炎支原體肺炎的早期防治提供理論依據。