氫氣和氧氣共存下三氯乙烯高效降解菌Pseudomonas putida HO1的分離鑒定與降解特性

薛 晨,李 翠,劉明慧,余錦濤,歐陽葳葳,劉 慧

(中國地質大學(武漢)環境學院,湖北 武漢 430078)

三氯乙烯 (trichloroethylene,TCE) 是一種優良的有機溶劑,廣泛應用在機械、電子、農藥等工業領域中,可用作制冷劑、金屬清潔劑、脫脂劑、洗滌劑和殺蟲劑等[1]。隨著現代工業的迅速發展,TCE被大量使用和不恰當排放,由于其具有致癌、致畸、致突變效應,從而威脅著人類健康[2-3]。TCE可通過多種途徑進入土壤和地下水中,而且具有較強的遷移性,使其成為地下環境中主要的有機污染物之一[4-5]。目前國內外對于有機污染場地的修復方法有很多,而利用微生物代謝降解有機污染物具有成本低廉、高效無害且無二次污染的特點,成為氯代烴污染場地的主要修復方法之一[6]。

TCE可以通過厭氧還原脫氯[7]、直接好氧氧化[8]和好氧共代謝[9]等途徑被微生物降解。在厭氧還原脫氯的過程中,高氯代烴常作為電子受體,H2作為常用的電子供體,從放能脫鹵反應中產生能量用于微生物生長[7]。在厭氧條件下,已發現和分離鑒定的能夠還原脫氯TCE的微生物有很多。如Maymó-Gatell等[7]從環境中獲得了一株能將四氯乙烯(PCE) 完全脫氯為乙烯 (VC) 的細菌Dehalococcoidesethenogenes195,這些微生物已被發現廣泛存在于土壤、地下水、河口沉積物等環境中。好氧氧化過程是在有氧條件下,O2作為電子受體,微生物利用TCE作為電子供體或碳源或依靠其他基質生長并代謝降解TCE[10]。O2是一種重要的電子受體,充足的O2供給可以促進好氧微生物代謝,從而促進污染物的好氧降解。如Dey等[8]和Mukherjee等[11]分別報道了以TCE作為唯一碳源的細菌Bacillussp.2479和Stenotrophomonasmaltophiliastrain PM102。許多微生物雖不能以TCE為直接碳源,但可在有氧條件下利用其他底物生長而共代謝降解低氯代烴[12-14],如假單胞菌屬(Pseudomonas)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)等。由于各類菌屬是在不同環境中篩選出來的,其氯代烴降解性能也存在一定的差異。如:Chen[15]在含有甲苯為碳源的土壤中分離得到一株假單胞菌屬菌株PseudomonasputidaASA86,在甲苯雙加氧酶作用下降解TCE;Chen等[16]分離得到一株以苯酚為共代謝基質的TCE高效好氧菌Pseudomonasputida。

本課題組前期研究發現,通過電化學體系向地下水環境中同時通入氫氣(H2)和氧氣(O2)顯著促進了TCE的降解,并指示該環境中可能存在能利用H2和O2降解TCE的微生物[17]。為此,本文研究的目的是在H2/O2共存的TCE污染沉積物中分離純化能同時利用H2和O2且能降解TCE的特殊微生物,通過對該特殊微生物進行分離與鑒定,研究其在H2/O2共存條件下對TCE的降解特性,考察其對TCE污染沉積物的強化修復的效果,為創建TCE污染地下環境修復新方法提供依據。

1 材料與方法

1.1 沉積物樣品來源

本試驗所用的沉積物來自天津某廢棄的化工廠,沉積物取樣深度約為5 m,此區域曾被高濃度的氯化溶劑污染。

1.2 H2/O2共存TCE污染沉積物體系中微生物的富集、分離與純化

圖1 微生物的富集培養裝置示意圖Fig.1 Microbial enrichment and cultivation device

1.3 菌株的形態觀察、碳源利用與物種鑒定

菌株的細胞形態采用掃描電子顯微鏡 (SEM,SU8010,日立公司,日本) 進行觀察,并采用BIOLOG ECO-plateTM(1506,BIOLOG公司,美國)研究該菌株對31 種不同單一碳源(6個生化類)的利用情況[19]。

菌株的種類鑒定:使用DNA提取試劑盒(天根DP302離心柱型,TIANGEN公司,北京)依照廠家說明書步驟提取細菌DNA;采用細菌16S rRNA 通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)在PCR擴增儀上進行DNA擴增,取菌種純化后的PCR產物,使用測序儀ABI3730-XL進行DNA測序;使用NCBI Blast程序將拼接后的序列文件與NCBI 16S數據庫中的數據進行比對,并利用MEGA 7.0軟件對序列進行編輯,采用鄰接法構建系統發育樹。

1.4 H2/O2共存條件下TCE的降解動力學和強化TCE污染沉積物的生物修復試驗

將分離獲得的菌株用于不同H2、O2條件下TCE的降解動力學試驗,試驗裝置見本課題組發表的文獻[17]。試驗采用220 mL玻璃瓶體系,混合培養基提前滅菌除氧后在厭氧手套箱 (COY,美國) 中加入玻璃瓶中,再加入5% 的菌懸液及TCE儲備液,在25 ℃、150 r/min下振蕩1 h后,測定樣品中TCE的初始濃度。未接種的螺口玻璃瓶作為對照,每組設兩個平行。提前在300 mL的聚四氟乙烯氣袋中分別裝入150 mL H2、150 mL O2、150 mL N2以及100 mL H2和50 mL O2的混合氣體,并將氣袋分別與玻璃瓶相連。試驗裝置在25 ℃的旋轉激振器上以150 r/min的轉速搖動。微生物強化TCE污染修復試驗采用250 mL玻璃瓶體系,在螺口玻璃瓶中加入40 g場地沉積物、200 mL無菌水、5%的菌懸液及TCE儲備液,瓶外連接裝有100 mL H2和50 mL O2的300 mL聚四氟乙烯氣袋,培養條件同上。定期從玻璃瓶取樣口收集2 mL樣品,迅速取1 mL加入至42 mL的棕色瓶中(提前裝入40 mL的超純水),測定樣品中TCE及可能中間產物的濃度。

1.5 分析方法

樣品中TCE及可能中間產物的濃度依據國家標準《水質揮發性有機物的測定 吹掃捕集/氣相色譜-質譜法》(HJ 639—2012)中方法,采用吹掃捕集-氣相色譜-質譜聯用儀(PT-GC-MS)(PT: Atomx,Teledyne Tekmar,美國;GC-MS:Thermo Fisher Scientific Inc.,美國)、Aligent DB-624毛細管柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)進行測定;樣品中溶解氫(DH)濃度采用DH儀(DH200,CLEAN,美國)進行測定,采用非侵入式O2傳感器(FIBOX 3,Pre-Sens GmbH,德國)對瓶內溶解氧(DO)濃度進行測量,氧氣傳感器貼片預先粘在玻璃瓶的內壁上[17]。

2 結果與討論

2.1 菌株HO1的形態特征、碳源類型與鑒定結果

2.1.1 菌株HO1的形態特征

在持續通入H2、O2、CO2氣體的條件下,從氯代烴污染沉積物中分離得到一個菌株(編號為HO1),具有降解TCE的能力。該菌株在LB平板上的菌落表面光滑,不透明,有凸起,呈淺粉色,大部分菌落直徑在0.9～1.1 mm之間[圖2(a)]。掃描電鏡結果顯示,該菌株細胞呈桿狀,長約1.5 μm,呈單細胞形態,細胞表面光滑[圖2(b)和2(c)]。

圖2 菌株HO1菌落及細胞形態Fig.2 Colony and cell morphology of strain HO1

2.1.2 菌株HO1的碳源類型

菌株HO1能利用1506微孔板的以下化合物作為唯一碳源生長:D-木糖/戊醛糖、D-半乳糖醛酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-絲氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、γ-羥丁酸、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、吐溫 40、吐溫 80、D-蘋果酸、苯乙胺、丙酮酸甲酯和肝糖,見表1。

2.1.3 菌株HO1的鑒定

通過測序得到菌株HO1的16S rRNA基因序列,提交GenBank,并利用Blast進行同源性序列比對,發現該菌株的16S rRNA基因序列與假單胞菌屬(Pseudomonas)成員高度同源,達到100%。與其關系最密切的菌株是土壤假單胞菌菌株Pseudomonasputidastrain ATCC-17485(登錄號AF094739.1),故選取15 株假單胞菌屬菌株的16S rRNA部分基因序列通過MEGA7軟件以Neighbor-Joining計算方式構建系統發育樹,見圖3。

圖3 菌株HO1的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HO1

由圖3可知,菌株HO1與已報道的假單胞菌屬親源關系最近,與Blast同源性序列比對結果一致。因此,該菌株被鑒定為假單胞菌Pseudomonasputida,命名為PseudomonasputidaHO1。

2.2 菌株HO1在不同H2和O2條件下對TCE的降解動力學過程

菌株HO1在不同H2和O2條件下對TCE的降解動力學過程曲線,見圖4。

注:Ct為t時刻TCE的濃度;C0為TCE的初始濃度。圖4 菌株HO1在不同H2、O2條件下對TCE的降解 動力學過程曲線Fig.4 Degradation kinetics curves of TCE by strain HO1 under different H2 and O2 conditions

由圖4(a)可知:菌株HO1在純N2條件下不能去除TCE,加入H2對TCE去除的影響不大,沒有產物的生成,而在加入O2條件下TCE濃度從反應的第1天就開始快速下降,在反應的前15 d內降解率為66.6%,之后TCE的降解變緩并趨于停止;在H2/O2(體積比為2∶1)共存條件下,TCE濃度在反應的前5 d下降較慢,表現出明顯的滯后期,說明該菌株最初不適應這種H2/O2共存的條件,而經過5 d的培養后TCE濃度開始較快地下降,30 d內去除了51.7%(13.9 μM) 的TCE。針對上述兩種TCE發生降解的體系,在培養液中沒有檢測到順式二氯乙烯(cDCE) 或三氯乙醛等中間產物,推斷是直接好氧代謝。

為了定量對比菌株HO1對TCE的降解速率,通過對TCE的降解曲線進行擬合,發現所試體系中TCE的降解過程符合一級動力學模型(相關系數R2>0.95),模擬結果與一級反應速率常數k值見圖4(b)所示。

由圖4(b)可知,在純O2和H2/O2共存的條件下,TCE降解的k值分別為(0.063 9±0.005 6) d-1和(0.047 5±0.004 9) d-1。

一般來說,假單胞菌屬的菌株更容易通過好氧降解進行TCE轉化[20-23]。本課題組前期的研究結果表明,在H2/O2共存條件下沉積物中形成了特定的微生物群落,其中假單胞菌屬的一些物種是H2/O2共存條件下特有的[17]。試驗過程中發現,不同試驗組的氣體消耗情況存在明顯的區別。在H2/O2共存體系中,菌株HO1對氣體的利用率很高,每5 d氣袋中100 mL H2和50 mL O2完全消耗,所以每隔5 d在原氣袋中補充100 mL H2和50 mL O2[如圖4(a)中紫色圓圈所示]。該現象表明菌株HO1能同時利用H2和O2。為了進一步弄清反應體系中H2和O2的濃度狀況和菌株HO1對H2和O2的利用情況,本試驗過程中監測了反應液中DH和DO濃度的變化情況,其監測結果見圖5。

圖5 菌株HO1在不同H2和O2條件下反應液中DH、 DO變化情況Fig.5 Changes of DH and DO in the reaction solution under different H2 and O2 conditions

由圖5可知:單獨供H2和O2的體系中一直維持較高濃度的DH和DO;而在H2/O2共存體系中DO濃度低于純O2體系,DH濃度始終在極低的水平,進一步說明該菌能同時利用H2和O2。

氫氧化細菌(hydrogen-oxidizing bacteria) 是一類能夠利用H2作為電子供體、以O2作為電子受體并同化CO2的無機化能自養細菌[24]。李忠玲等[25]報道了一株具有促生作用的氫氧化細菌為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens),該菌株能同時利用H2和O2作為能量供細胞生長。本研究分離得到的PseudomonasputidaHO1與Pseudomonasfluorescens一樣,其能夠同時利用H2和O2,在H2/O2/CO2共存的條件下生長,本研究首次報道了假單胞菌種Pseudomonasputida能夠在利用H2和O2的同時降解TCE。

2.3 菌株HO1對TCE污染沉積物的強化修復效果

為了探究菌株HO1對TCE污染的強化修復能力,本研究將該菌株加入到采自污染場地的實際沉積物中,對比了未加菌TCE污染沉積物體系,檢測TCE的降解效果,其結果見圖6。

由圖6可知:在H2/O2共存體系中,原始沉積物中的土著菌群能夠代謝TCE,即在3次添加TCE(TCE的初始濃度為30 μmol/L)溶液時,土著微生物需要6～19 d能夠將加入的TCE降解完全,期間生成14.98 μmol/L厭氧降解產物cDCE;當加入菌株HO1時,TCE的降解時間縮短至2～4 d,尤其是在第3次添加TCE后其降解速率更快,生成的cDCE在第13 d達到了最大濃度20.37 μmol/L,隨后cDCE濃度則快速下降至0 μmol/L;在滅菌沉積物組中,TCE的濃度有所減少但是始終沒有cDCE的產生,說明上述兩處體系中TCE的降解是微生物作用導致。

此外,圖6結果表明,H2/O2共存體系中加入和未加入菌株HO1的沉積物中TCE降解的第一步是將TCE還原脫氯成cDCE,但體系中未檢測到進一步還原脫氯的中間產物。因此,推斷cDCE可能通過好氧途徑降解。

圖7為不同體系試驗后的CO2檢測結果。

圖7 不同試驗體系中CO2的GC-MS譜圖Fig.7 GC-MS spectra of CO2 in different experimental systems

由圖7可知:在滅菌沉積物組中幾乎沒有CO2的生成;而在加菌和未加菌的沉積物組中檢測到了CO2的生成,其峰面積分別為1 984 174 136和1 522 660 655。由此判斷,試驗體系中的CO2主要來自沉積物中有機物(包括TCE)的好氧降解,而相對于未加菌試驗體系,加了菌株HO1的試驗體系中增加的CO2產生量暗示著TCE發生了好氧降解?；谝陨戏治隹梢酝茢?菌株HO1降解TCE的途徑為:先將TCE厭氧脫氯至cDCE,然后再好氧降解為CO2。

2.4 菌株HO1的科學價值與應用前景

本研究獲得的菌株PseudomonasputidaHO1為首次報道的一株能利用H2和O2生長同時降解TCE的細菌,能夠在純O2環境中或H2/O2共存環境中將TCE最終降解為CO2,并且能夠利用H2作為電子供體,以O2為電子受體,CO2作為無機碳源合成自身有機物質,為細胞生長提供能量。這表明該菌能夠在寡有機物的地下環境中利用H2和O2,同時參與環境中的TCE降解,對TCE污染地下環境的生物修復起著重要作用。通過電化學體系向地下環境中同時通入H2和O2能顯著促進TCE的降解[17],加入特征微生物能有效強化TCE污染沉積物的修復效果。菌株HO1以H2為電子供體、O2為電子受體并降解TCE的方式為去除寡有機質環境中的氯代污染物提供了一種有效的途徑。因此,該菌株不但對于認識氫氧共存環境中氯代有機污染物的降解機制具有重要的科學價值,而且有望為強化寡有機物的地下環境中TCE污染的生物修復提供新思路。

3 結 論

1) 從受氯代烴污染的沉積物中富集、分離得到一株能利用H2和O2降解TCE的菌株PseudomonasputidaHO1。

2) 該菌株在純O2和H2/O2共存條件下對TCE的降解過程符合一級動力學模型,其TCE降解的一級反應速率常數k分別為(0.063 9±0.005 6) d-1和(0.047 5±0.004 9) d-1。

3) 將菌株HO1添加至污染場地沉積物中,在H2/O2共存條件下顯著促進了TCE的降解速率,利用該菌株,通過通入H2/O2有望強化TCE污染地下環境的生物修復。

4) H2/O2共存條件下菌株HO1對TCE的降解途徑為:先將TCE脫氯為cDCE,然后再好氧降解為CO2。