網絡藥理學和分子對接探究鼻靈散治療CRS的作用機制*

雷 琳 蔣巧萍 雷志鈞 湯六凱 王志琪 王丹艷

鼻炎分為慢性鼻炎、急性鼻炎、藥物性鼻炎、 萎縮性鼻炎[1],其中慢性鼻炎最為常見,按病理分類,慢性鼻炎有變應性鼻炎(AR)和非變應性鼻炎(NAR)2種[2]。AR又稱過敏性鼻炎,目前尚無療效確切、不良作用少的藥物和療法[3]。反復遷延發作的AR和NAR都會形成慢性鼻炎,這是一種鼻部常見的慢性炎癥性疾病。流行病學資料顯示,慢性鼻炎和AR呈相同的趨勢增長,兩者存在某些內在聯系以及類似炎癥機制[4]。

鼻靈散是趙俊欣[5]繼承師父張大昌的傳驗方,進一步結合自己的臨床經驗組方而成,該方使用多年,治愈者不勝枚舉,取得了可重復性的治療效果。鼻靈散由辛夷、柴胡、桔梗、葶藶子組成,組方平和,臨床治療頑固性鼻竇炎效果頗佳,適用于慢性鼻竇炎,頭痛(包括額、眼等部位疼痛),鼻流膿性涕、黏液性涕,鼻塞等癥。

中醫藥成分復雜、配伍靈活的特點使其治療慢性疾病有一定的優勢,但也存在著起效較緩、治療機制不明確等問題。本研究采用網絡藥理學的方法,從藥物的物質基礎出發,從整體角度分析鼻靈散治療鼻炎的分子機制,通過大數據分析和“多成分-多靶點-全方位”的研究,為中藥作用機制研究提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選借助中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)檢索鼻靈散中的中藥化學成分及其相應的藥效學參數[6]。在Uniprot蛋白質數據庫中將化合物的作用靶點進行規范。結合檢索結果建立鼻靈散的化學成分數據庫。

1.2 疾病相關靶點獲取以“rhinitis”“allergic rhinitis”“nasosinusitis”等為關鍵詞,在GeneCards[7]、OMIM數據庫[8]中進行檢索,并在DRUGBANK數據庫[9]中尋找治療鼻炎的臨床一線西藥作用靶點予以補充。

1.3 藥物-活性成分-靶點網絡的構建通過Venny 2.1.0將鼻靈散的靶點與鼻炎的靶點取交集,所得交集靶點集為鼻靈散的活性成分作用于鼻炎的潛在核心靶點。通過CytoScape 3.7.1構建鼻靈散“藥物-活性成分-靶點”網絡圖,利用CytoScape 3.7.1內置工具分析有效成分及靶點的網絡拓撲參數,并根據網絡拓撲學參數對核心靶點及發揮藥效的主要活性成分進行分析。

1.4 鼻靈散成分-鼻炎靶點的PPI網絡構建將潛在核心靶點集提交至STRING 11.0數據庫[10],設置生物種類為“Homosapiens”,構建蛋白互作(PPI)網絡模型,并將結果導入CytoScape 3.7.1中,使用內置工具對靶點的網絡拓撲參數進行分析。

1.5 靶點功能與通路的富集分析Metascape平臺 擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數據資料。將鼻靈散治療鼻炎的潛在核心靶點集錄入Metascape平臺,設置P<0.01,進行基因本體分析和途徑分析,包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)。

1.6 分子對接為了初步考察網絡藥理學的分析結果的準確性,對1.3項下鼻靈散“中藥-活性成分-鼻炎靶點”網絡圖中網絡結點度值(Degree)≥10的活性成分和靶點蛋白進行分子對接。先獲取化合物與靶點蛋白的3D結構;再使用AutoDock Tools軟件將小分子和蛋白質的3D結構轉換為“PDBQT”格式;最后使用AutoDock vina軟件進行分子對接。打分系統使用結合自由能(Predicted binding affinity),Affinity的絕對值越大,表示預測的配體與蛋白質分子之間的結合性越好。

2 結果

2.1 鼻靈散活性成分靶點的獲取在TCMSP數據庫中,以OB>30%,DL≥0.18為篩選條件,初步篩選得到柴胡活性成分13種,桔梗活性成分4種,葶藶子10種,辛夷15種;從相關文獻中補充鼻靈散化合物26種,其中柴胡含7種化合物,葶藶子含14種化合物,辛夷含5種化合物。同時通過知網等論文大數據整理,有些化合物雖然DL<0.18,但含量較高,仍納入。綜合上述結果并刪除重復項,一共收集了58種鼻靈散化合物。

用TCMSP數據庫提供的化合物靶點預測的功能接口對化合物進行靶點預測。辛夷對應靶點48個,柴胡對應靶點206個,桔梗對應靶點70個,葶藶子對應靶點190個,合并后刪除重復值共得到靶點250個。

2.2 鼻炎相關靶點獲取根據Genecards、OMIM、DRUGBANK數據庫挖掘鼻炎相關基因,去掉重復值后有1323個,將鼻炎基因與藥物靶點基因取交集,最終獲得58個鼻靈散與鼻炎的靶基因。

2.3 主要成分-作用靶點網路構建運用CytoScape 3.7.1構建鼻靈散“藥物-成分-靶點”網絡圖,共有437條邊,116個節點。柴胡和葶藶子的共有活性成分:異鼠李素、山奈酚、槲皮素。通過CytoScape 3.7.1中的Network Analyzer分析鼻靈散治療鼻炎網絡拓撲學參數,得到核心成分及核心作用靶點。見表1。

表1 鼻靈散主要活性成分網絡節點特征參數

2.4 蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建與分析將鼻靈散與鼻炎的58個交集基因提交至STRING 11.0平臺,得到鼻靈散靶點PPI網絡及相關數據。為了更直觀地分析蛋白質相互作用程度,將所得數據導入CytoScape 3.7.1,通過Network Analyzer分析,可知蛋白質相互作用(PPI)網絡中節點平均連接度數為20.38,以Degree>30為核心靶點的篩選條件,共篩選出15個靶點,這些靶點與其他蛋白的相互作用更強,在該網絡中發揮了關鍵作用。

2.5 核心靶點富集分析與可視化采用Metascape數據庫對鼻靈散治療鼻炎的主要靶點進行GO和KEGG分析,通過Venny 2.1.0對結果進行可視化。

GO-BP分析結果表明,鼻靈散主要參與的生物學過程包括細胞因子介導的信號通路(Cytokine-mediated signaling pathway)、細胞對脂多糖的應答(Response to lipopolysaccharide)、細胞對細菌起源分子的應答(Response to molecule of bacterial origin)以及細胞對氮化合物的應答(Cellular response to nitrogen compound)。

GO-MF分析結果顯示,相關靶點治療鼻炎的功能富集于與細胞因子受體結合(Cytokine receptor binding)、細胞因子活動(Cytokine activity)、受體調節活動(Receptor regulator activity)、受體配體活動(Receptor ligand activity)、G蛋白偶聯的乙酰膽堿受體活動(G protein-coupled acetylcholine receptor activity)。

KEGG分析顯示,其參與的通路主要有細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥通路(Pathways in cancer)、動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、瘧疾(Malaria)、美洲錐蟲病(Chagas disease American trypanosomiasis)等。

2.6 分子對接模擬選擇2.3項中“中藥-活性成分-鼻炎靶點”Degree值>9的7個核心成分和Degree值>10的10個潛在蛋白靶點進行分子對接,并對蛋白靶點的原配體進行分析。保留結合自由能(Predicted binding affinity,kcal mol-1)最高絕對值的分子對接結果,并與原配體的對接結果進行比較,結合自由能的絕對值越高則代表配體與蛋白質結合能力越強。數據經熱圖分析,使用Paymol軟件對蛋白質和活性化合物相互作用進行分析,發現核心成分與靶點之間具有良好的結合活性。

3 討論

3.1 成分分析通過數據挖掘初步篩選出鼻靈散治療鼻炎的活性成分有槲皮素、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、百里香酚、濱蒿內酯等。有研究表明,槲皮素可以減輕大鼠變應性鼻炎癥狀,山奈酚對肥大細胞所介導的過敏性鼻炎有一定的抑制效應,木犀草素可以通過多種途徑緩解炎癥反應。分子對接驗證也表明,槲皮素、山奈酚、木犀草素與主要靶點(PTGS2、PTGS1、NOS2、RELA)的結合能力較強,因此推測鼻靈散BLS主要是通過槲皮素、山奈酚、木犀草素等活性成分來改善鼻炎癥狀。辛夷中木蘭脂素具有較強的抗過敏作用,對炎癥早期有明顯的抑制作用,可視為辛夷抗炎、抗過敏作用的活性成分。

目前數據挖掘得到的大部分中藥方劑主要成分皆為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等,這些成分具有抗病毒、抗炎、抗過敏等基本藥理作用,臨床配伍使用不同的引經藥,即可將藥物的聯合功效引至機體相應的部位、器官或系統,起到“異病同治、同病異治”,治本的臨床效果,從而解釋中藥“多成分-多靶點-全方位”的作用原理。鼻靈散中辛夷作為引經藥,能將上述藥物成分引入鼻部,起到治療作用。

3.2 作用靶點分析通過 PPI網絡分析與“藥物-成分-靶點”網絡相映射發現鼻靈散中活性成分可能通過調控 PTGS2、PTGS1、IL-6、IL1B、NOS2、GABRA2 等核心靶點干預鼻炎。PPI 網絡分析與“藥物-成分-靶點”網絡相映射的結果顯示,PTGS2 的連接度均排在前列,PTGS2 又稱環氧合酶 2(COX-2),是前列腺素E2(PGE2)生產中的關鍵步驟,其表達與機體免疫活性密切相關,COX-2的過度表達會導致血管壁的炎性反應。鼻靈散中存在 COX-2 抑制劑,推測通過降低 COX-2 表達發揮抗炎的效果。 PPI 網絡分析結果顯示IL-6 的連接度最高,IL-6 是一種具有廣泛生物學活性多功能的細胞因子,也是各種炎癥感染的關鍵細胞因子, 它促使疾病進展并維持免疫反應,在適應性免疫和慢性炎癥等病理過程中起重要作用。

3.3 信號通路預測在對 BLS 作用靶點參與的生物學過程進行 KEGG 富集分析時發現,鼻靈散治療鼻炎的通路主要有 IL-17 信號通路、TNF 信號通路。IL-17 是 TH17 細胞分泌的特征性細胞因子,在抵抗病原體入侵以及誘導和維持慢性炎癥的過程中發揮了重要的作用。TNF-α是一種促炎因子,具有重要的調控免疫,控制感染作用。分子對接結果顯示,鼻靈散治療鼻炎的主要活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇與作用靶點PTGS2、NOS2、 GABRA2、PTGS1的結合活性均較強,與本研究結果吻合。

綜上所述,本研究通過數據挖掘,找到部分預測的活性成分和靶點關系:證明了鼻靈散的成分與AR或CRS的共同靶點之間存在良好的化學連接,鼻靈散可能通過調節細胞炎癥因子表達、介導物質代謝、影響細胞存活/凋亡途徑等途徑來治療,且與細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)等信號通路密切相關。鼻靈散在臨床上治療頑固性的鼻炎-鼻竇炎有很好的療效,本項目組首次對該方進行研究,通過數據挖掘為中醫臨床治療慢性鼻炎的經驗方提供了現代分子依據。