聚乙烯農用地膜降解菌的篩選與鑒定

閔逸雯,王小兵,2*,陳悅,汪曉麗

(1.揚州大學 環境科學與工程學院,江蘇 揚州 225127;2.江蘇省有機固廢廢棄物資源化協同創新中心,江蘇 揚州 225127)

聚乙烯(Polyethylene,PE)因其生產成本低、耐水、耐用等優點,被廣泛應用于農業(如農用地膜)、生活用品(如食品袋)、建筑(如管道)等領域,成為日常生活中不可替代的材料[1]。我國農業設施較多,農用聚乙烯薄膜應用也較多。目前,中國使用的農用塑料薄膜主要是12 μm以下的超薄薄膜,這種薄膜非常脆弱,容易破碎,難以回收利用[2]。據農業部門統計,中國耕地薄膜殘留量以60～90 kg/hm2為主,最高達160 kg/hm2。中國地膜覆蓋農作物已有40多年的歷史,累計覆蓋面積達2 000萬km2,進入土壤的塑料薄膜超過2 000萬t。中國農田塑料薄膜殘留嚴重。

目前世界上處理這些極難自然分解的聚乙烯塑料的主要方法是填埋、焚燒[3]、堆肥等比較原始的方法。但這些方法都會造成生態環境的二次污染,填埋的塑料經過一段時間后會變成危害較大的微塑料[4]。當前研究認為塑料生物降解是塑料向礦物材料轉化,增加土壤肥力,減少塑料垃圾向環境累積以及降低廢物管理成本等方面的一種有效手段。所以利用生物降解這一環境友好處理手段能較好解決治理塑料垃圾污染問題。

從70年代開始就有研究報告PE塑料被微生物降解的情況,以PE是唯一碳源從土壤、垃圾填埋場、海洋、昆蟲腸道及其他不同生境中分離到的部分菌株可用于塑料的生物降解[5-6]。以垃圾填埋場為例,已有研究得到2株假單胞菌RD1-3、N1-2,它們均能對PBAT塑料進行高效地降解[7]。這為PE塑料垃圾的治理提供一種新思路。

為了緩解殘留農用地膜聚乙烯對設施農田土壤的影響,本論文以農用地膜塑料(聚乙烯,PE)為唯一碳源,采用富集培養法從設施農田土壤中篩選高效降解菌,并探索可能的降解機制,為緩解廢棄農用地膜污染,改善農田生態環境提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗供試PE地膜購置于某農用市場厚度為0.004 mm的農用地膜。降解菌從高郵某設施大棚土壤中分離。

MSM培養基:MgSO40.20 g,CaCl20.02 g,KH2PO410.00 g,K2HPO41.00 g,NH4NO31.00 g,FeCl30.05 g,1.00 L蒸餾水,pH值7.00,121 ℃高壓滅菌20 min。NA培養基:胰蛋白胨 10.00 g,牛肉粉 3.00 g,氯化鈉 5.00 g,蒸餾水1.00 L,瓊脂,pH值7.30,121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 PE降解菌的分離和篩選

農用地膜滅菌處理:將PE地膜剪成大小為2 cm×1.5 cm的片狀,然后依次浸泡于2% SDS、75%乙醇、95%乙醇中4 h,再用無菌水沖洗干凈,置于紫外滅菌燈下滅菌15 min。

采取高郵某設施大棚內1 g新鮮土壤,加入100 mL 無菌水充分搖勻,制得土壤稀釋液;取20 μL稀釋液接種到100 mL MSM培養基中并加入1片預處理過的PE地膜,于25 ℃、150 r/min培養,待菌液濃度上升并趨于穩定后,取1 mL菌液到100 mL NA培養基進行傳代培養,每7 d進行一次傳代,3次重復。取0.2 mL培養液涂布于NA培養基,放置于28 ℃恒溫培養箱中培養,長出菌落后,按照菌落特征挑取單菌落,純化多次直到獲得純菌株,用NA 斜面培養基4 ℃保存。

1.2.2 PE降解菌對PE地膜降解效率

PE降解菌對PE地膜降解效率采用PE地膜失重率來計算。從初篩的PE降解菌斜面培養基接種到50 mL NA液體培養基中搖瓶培養18 h,再以0.5 μL接種量分別接種到50 mL含0.1 g 滅菌的PE地膜的MSM培養基中。于35 ℃、150 r/min培養28 d,將不接種菌懸液的含有PE農用地膜的MSM培養基在相同條件下培養,作為空白對照(CK)。稱重培養前處理過的PE地膜質量,記為m0。過濾回收降解實驗后的PE地膜,采用70%乙醇進行四階段清洗,放入50 ℃烘箱中過夜干燥后稱重,記為m1。計算公式如下:

PE地膜失重率=(m0-m1)/m0×100%

(1)

1.2.3 以PE為唯一碳源培養基中降解菌生長曲線和pH值變化特征

取活化0.5 μL降解菌培養液接種于含有 2 g PE地膜的 100 mL MSM培養基中,27 ℃,120 r/min 振蕩培養28 d,每隔3 d對培養基進行OD值和pH值測定。

1.2.4 降解菌對PE地膜的表面特征影響

將經降解菌處理 28 d 后的塑料地膜樣品用蒸餾水洗滌 3 次,再用 75%乙醇沖洗,去除表面的細菌,使最大表面暴露出來,以便觀察。在25 mA、0.3 MPa氬氣氣氛下濺射金微塑料涂層,使用S-4800掃描電子顯微鏡(SEM,株式會社日立制作所)進行分析。

1.2.5 降解菌對PE地膜的表面官能團的影響

用 Nexus 670 FTIR 光譜儀(美國 Nicolet)對PE地膜進行FTIR表征,長度范圍為 4 000～400 cm-1,分辨率為 4 cm-1,掃描次數為 20 次。

1.2.6 降解菌株16S rDNA測定

降解菌基因組 DNA的提取方法均按常規方法操作[8]。用Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO)試劑盒提取降解菌DNA,采用微生物通用引物515FmodF(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') 806RmodR(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3') 對16S rRNA基因V4可變區進行PCR擴增,擴增程序如下:95 ℃預變性3 min,27個循環(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),然后72 ℃穩定延伸10 min,最后在4 ℃進行保存,檢測合格后使用Illumina Miseq平臺測序。在EzBioCloud網站進行Blast序列比對系統發育樹分析,鑒定菌株種屬。基因測序委托南京生物醫藥科技有限公司完成。

2 結果與分析

2.1 PE降解菌的篩選

以PE農用地膜為唯一碳源,通過富集培養法從設施大棚土壤中獲得四種不同菌落形態的菌株,將四株菌株命名為BP1、BP2、BP3和BP4。采用PE地膜失重率來計算PE降解菌對PE地膜降解效率,結果見圖1。結果表明,BP1、BP2、BP3和BP4四株菌降解率分別為9.99%,6.98%,8.35%和6.43%。BP1降解效果顯著高于其他三株菌株。

圖1 不同菌株培養基中微塑料的降解率

在NA培養基上,BP1菌株菌落呈現出奶白色、濕潤的圓形,表面光滑濕潤且有光澤,邊緣光滑,中心有凸起(圖2)。

圖2 BP1菌落形態

2.2 以PE為唯一碳源培養基中BP1菌株生長曲線和pH值變化特征

以PE地膜為唯一碳源,BP1生長曲線見圖3。0～3 d,BP1菌株適應新的生長環境,開始代謝繁殖,增長較為緩慢;3～15 d,BP1菌株增長速率顯著提高,說明細菌可以利用PE地膜作為唯一碳源來進行自身的生長繁殖;15～28 d,BP1繁殖速度下降,生物量趨于平緩。

圖3 降解過程中菌株生物量變化

pH值的變化表明細菌在進行新陳代謝,這使微生物能夠繼續生長。每隔3 d測量一次液體培養基的pH值,結果見圖4。培養基在第14 d達到最低的pH值8.6,然后逐漸上升并穩定下來;Gong等人[9]認為,與塑料一起培養的微生物能逐漸緩慢地降解塑料,降解過程中改變了塑料聚合物基質的微觀結構,分泌出酸性副產品,使培養基的pH值降低。而在這個過程具有代謝活性微生物分泌多種胞內和胞外酶到培養基中,這些酶可能在聚合物降解中發揮了作用。在聚合物降解過程中,復雜的聚合物首先被外酶分解成短鏈或單體,這些外酶足夠小,可以穿透細胞壁,在解聚過程中被用作碳或能量來源[10]。

圖4 實驗過程中的pH值變化

2.3 微塑料表征

2.3.1 SEM結果分析

通過掃描電鏡(SEM)分析降解菌BP1處理后PE農用地膜的表面變化情況。在經過BP1菌株處理28 d后,PE農用地膜表面發生一些凹槽、生物侵蝕,未經過BP1菌株處理PE地膜表面光滑平整(圖5);從圖5中很清楚可以看到有菌落黏附在薄膜表面,這可能是由于微生物菌種處理塑料薄膜后發生的酶解過程。經過BP1菌株處理后,薄膜的表面產生破損,增加了薄膜的粗糙度,表明降解菌已經對地膜進行了生物降解。

圖5 PE地膜塑料降解前后表面形態特征

2.3.2 FTIR結果分析

FTIR可以觀察到化學分子的變化,任何官能團的形成或消失,任何氧化劑或填充物的存在。通過FTIR對BP1降解菌處理前后PE農用地膜表明官能團變化進行分析(圖6)。

圖6 PE地膜塑料降解前后FTIR光譜特征

當微生物引入氧化基團時,非極性鍵轉化為極性鍵,導致不穩定性增加,并為微生物定居和酶斷裂提供場所[11]。BP1菌株處理后的PE農用地膜與對照相比,出現一些波長峰的消減,從圖6中可以發現,1 305,2 900 cm-1的振動峰有明顯削弱和位置偏移,其中C-H伸縮振動峰在2 900 cm-1處削弱,1 740 cm-1處酯羰基指數降低。PE是一種線性飽和碳氫化合物,C-H 伸縮振動峰與酯羰基指數的變化間接說明降解菌株已在攻擊利用PE而導致 C-H 減弱,表明接種菌株使PE農用地膜發生了生物降解,導致其表面的化學功能團發生了變化。

2.4 PE降解菌的分子生物學鑒定

將BP1進行了分子生物學鑒定。將擴增片段送往南京生物醫藥科技有限公司測序,顯示擴增子序列長度為1 490 bp(獲得序列登錄號 ON545815),將所得序列在NCBI數據庫中進行blast對比,利用MEGA11.0構建分子系統發育樹如圖7所示。結合BP1的形態特征與形態特性,結果表明BP1菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。鑒定該菌為芽孢桿菌屬的一種。

圖7 BP1菌株系統發育樹

3 結論

(1)以PE農用地膜為唯一碳源篩選到BP1、BP2、BP3和BP4四株PE降解菌,其中BP1菌株降解效率達到9.99%。

(2)經過BP1菌株降解后,PE農用地膜產生了孔洞、裂痕和凹坑,PE農用地膜表面酯羰基指數降低。

(3)通過形態學和分子生物學分析表明,BP1菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissp.),BP1菌株顯著提高PE農用地膜的降解速率,這為緩解廢棄農用地膜污染問題,改善農田生態環境提供理論支撐。