基于代謝組學的‘蒙農三葉草1號’與結瘤相關的根系代謝物研究

劉嘉偉, 王明玖*, 曹克璠, 何麗君, 郝新艷, 張慧敏, 郝 璐

(1.內蒙古農業大學草地資源教育部重點實驗室/草原與資源環境學院, 內蒙古 呼和浩特 010011;2.內蒙古農業大學農學院, 內蒙古 呼和浩特 010019)

代謝組學是研究生物體內源性代謝物質的種類、數量及其在內外因素作用下變化規律的學科,是生物體在內外因素共同作用下的最終結果。我們可通過代謝物的含量或濃度變化研究植物的生理狀態特征,從而對植物特定生化過程有更深層次的理解[1]。隨著時代的快速進步,代謝組學技術多用于探究植物應對不同環境脅迫的代謝物變化[2],對于分析豆科植物與根瘤菌共生固氮過程中代謝產物的變化也同樣發揮重要的作用。共生固氮是豆科植物和相應根瘤菌之間發生的一系列復雜的化學和物理反應,包括引起雙方信號傳遞過程、寄主選擇和抑制植物防御系統的基因表達的變化。豆科植物—根瘤菌的相互作用通常始于氮貧瘠的土壤中,豆科植物分泌出類黃酮的代謝物[3-4],根瘤菌把類黃酮作為識別信號,通過Nod基因進行合成和釋放[5]。豆科植物根系分泌物中的黃酮類化合物在低氮條件下對根瘤菌有趨化信號作用[6],與異黃酮化合物一樣,黃酮類化合物同樣具有寄主特異性,有研究表明寄主特異性類黃酮與根瘤菌NodD蛋白相互作用,轉錄因子誘導Nod基因的表達,導致Nod因子的產生[7-8],由寄主特異性Nod基因編碼產生的酶,會影響根瘤原基對寄主的選擇[9]。

高加索三葉草(Trifoliumambiguum)是一種多年生根蘗型豆科牧草,原產于東歐和高加索地區,具有適應性強、耐寒性突出的特點[10],在原產地其能與根瘤菌結合進行結瘤固氮作用[11-12],固氮效率與白三葉相似[13-14]。但是由于高加索三葉草對根瘤菌具有特異選擇性[15],當引種至其他地區栽培時,不能與根瘤菌發生互作關系,大多會失去結瘤和固氮能力,導致高加索三葉草前期建植能力弱,影響推廣種植。

由內蒙古農業大學培育出的‘蒙農三葉草1號’(TrifoliumambiguumBieb. ‘Mengnong No.1’)是中國第一個高加索三葉草品種,其適應性強、生態位廣,在適應性、耐牧性、生物產量方面優于白三葉(T.repens)和紅三葉(T.pratence),更適合在北方寒冷地區生長和種植[16-17]。經過多年研究發現‘蒙農三葉草1號’可以與本土根瘤菌結合,進行結瘤固氮作用,突破了高加索三葉草不能與當地根瘤菌結合這一瓶頸。因此,本研究以‘蒙農三葉草1號’為研究對象,探究與根瘤菌相互作用的機理,研究根瘤菌對根系代謝物的影響,對解釋高加索三葉草結瘤固氮機理,為增強高加索三葉草的結瘤固氮能力提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為內蒙古農業大學選育的高加索三葉草品種‘蒙農三葉草1號’。供試菌株為‘蒙農三葉草1號’根瘤中分離得到的根瘤菌,經過16S rDNA鑒定為豌豆屬根瘤菌(RhizobiumLeguminosarum)。

1.2 樣品的處理及采集

幼苗培養:選取籽粒飽滿的‘蒙農三葉草1號’種子200粒,用體積分數75%酒精消毒10 min,無菌水沖洗干凈后,置于鋪有濾紙的無菌培養皿中,26℃避光萌發4 d。將萌發后的幼苗移栽至裝滿無菌蛭石的10 cm×10 cm的黑色營養缽中,每缽移栽3株,施加100 mL的無菌Hoagland無氮營養液。將營養缽置于光照培養箱中(26℃;光照16 h/黑暗8 h;相對濕度50%)繼續培養1 d后,進行試驗。

Hoagland無氮營養液:435 mg·L-1K2SO4;136 mg·L-1KH2PO4;241 mg·L-1MgSO4;36.7 mg·L-1FeNaEDTA;0.83 mg·L-1KI;6.2 mg·L-1H3BO3;16.9 mg·L-1MnSO4·H2O;8.6 mg·L-1ZnSO4·7H2O;0.25 mg·L-1Na2MoO4·2H2O;0.025 mg·L-1CuSO4·5H2O;0.025 mg·L-1CoCl2·6H2O;444 mg·L-1CaCl2。

根瘤菌菌懸液的制備:將前期已經分離并鑒定得到的根瘤菌分別接種至YMA液體培養基中[18],于180 r·min-1、28℃振蕩培養至光密度值(OD600值)>0.5時,10 000 r·min-1離心10 min,倒掉上清液用無菌水配置成OD600值為0.5的菌懸液,備用。

試驗處理:試驗設置接種根瘤菌和不接種根瘤菌(CK)2個處理。接種根瘤菌處理方法為:在無菌條件下,在移栽有3株幼苗的黑色營養缽中,用移液槍將1 mL根瘤菌菌懸液(OD600=0.5)滴至每株幼苗根部后,添加100 mL無氮Hoagland營養液,將其置于光照培養箱中培養。不接種根瘤菌(CK)處理方法為:在無菌條件下,在移栽有3株幼苗的黑色營養缽中,在幼苗添加100 mL無氮Hoagland營養液,將其置于光照培養箱中培養。每處理重復10缽。光照培養箱的培養條件為:溫度26℃;光照16 h/黑暗8 h;相對濕度50%。將培養9 d的不同處理的‘蒙農三葉草1號’幼苗根系用液氮速凍,并于-80℃保存備用,其中接種根瘤菌的樣品編號為G_9,不接種根瘤菌(CK)的樣品編號為CK_G_9,每組樣品設置6次重復。

1.3 根系代謝產物的LC-MS分析

將“1.2”中的樣品G_9和CK_G_9送至上海美吉生物醫藥科技有限公司,利用非靶向代謝技術(LC-MS/MS)進行代謝產物的定性定量分析。將‘蒙農三葉草1號’根系進行前期處理,將得到的上清液進行上機分析,運用AB-SCIEX公司的超高效液相色譜串聯飛行時間質譜UPLC-TropleTOF系統進行LC-MS分析。取等體積的所有樣本代謝物混合制備成質控樣品(Quality control,QC),在儀器分析過程中,每10個樣品中插入1個QC樣品,以考察整個分析過程的重復性。將得到的LC-MS原始數據運用Progenesis QI(Waters Corporation,Milford,USA)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊,最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的數據矩陣,將MS和MSMS質譜信息與代謝公共數據庫HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)數據庫進行匹配,得到代謝物信息[19]。

預處理后的數據上傳至美吉生物云平臺上(https://cloud.majorbio.com)進行數據分析。運用R軟件包ropls(Version1.6.2)進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA),對數據的可靠性進行初步判定。對得到的可靠數據進行Student’s t檢驗和差異倍數分析。基于PLS-DA模型得到的變量權重值(VIP)和student’s t檢驗P值來確定差異代謝物,VIP >1、P<0.05的代謝物即為顯著差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系結瘤情況

‘蒙農三葉草1號’接種根瘤菌后,根系出現了結瘤現象(圖1)。根瘤數量、根瘤重量與根瘤面積在接種根瘤菌后出現了顯著性的增加(P<0.05)(表1)。

表1 接種與未接種根瘤菌的‘蒙農三葉草1號’結瘤情況比較

圖1 接種與未接種根瘤菌的‘蒙農三葉草1號’結瘤及生長情況對比

2.1 接種根瘤菌的‘蒙農三葉草1號’根系中代謝產物的主成分分析

對樣品進行主成分分析,G_9與CK_G_9樣品間相互分離,證實試驗數據準確且可靠。處理間存在顯著的差異,在圖中距離較遠,說明重復性較高。QC重疊在一起,說明檢驗的數據可靠性高,可以進行下一步試驗(圖2)。

圖2 接種與未接種根瘤菌的‘蒙農三葉草1號’根系中代謝產物的主成分分析

2.2 接種根瘤菌的‘蒙農三葉草1號’根系中代謝產物的偏最小二乘判別分析

通過對不同處理下根系代謝產物進行PLS-DA分析,不同處理下的樣品均分列于兩側,說明兩組樣品分離程度較大(圖3)。通過PLS-DA置換檢驗(圖4),并對模型進行參數計算,樣品間的模型主要質量參數R2X為0.513,R2Y為0.991,Q2為0.937,說明PLS-DA模型穩定可靠性較好(表2)。

表2 PLS-DA模型參數表

圖3 接種和未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中代謝產物的偏最小二乘判別分析

圖4 接種和未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中代謝產物的偏最小二乘判別分析的置換檢驗

2.3 ‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物分析

運用單維分析(t檢驗)和多維分析PLS-DA相結合的方法(VIP>1,P<0.05),得到接種與未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物(Differential Metabolite,DAM),結果共篩選出249個DAMs(圖5)。

圖5 接種與未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物的火山圖

2.4 ‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物的KEGG通路分析

對全部的DAMs進行KEGG統計分析發現,DAMs在新陳代謝過程中分別在“次生代謝產物的生物合成”“氨基酸代謝”“碳水化合物代謝”“其他氨基酸代謝”“核苷酸代謝”和“輔助因子和維生素代謝”中注釋15,9,4,4,3和3個DAMs;在遺傳信息處理中,DAMs在“翻譯過程”中注釋到2個;在環境信息處理中,DAMs在“信號轉導”和“膜運輸過程”中分別注釋了1和3個(圖6)。

圖6 接種與未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物的KEGG通路分析

2.5 ‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物KEGG富集分析

對DAMs進行KEGG富集分析發現,共有75個DAMs富集在47個KEGG通路中,其中主要富集在黃酮和黃酮醇的生物合成,精氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,類黃酮生物合成,乙醛酸和二羧酸代謝和檸檬酸循環通路,在泛酸鹽和輔酶A的生物合成、賴氨酸生物合成、組氨酸代謝、甘油磷脂代謝、賴氨酸降解、ABC轉運體和苯丙烷代謝通路中也有富集(圖7)。

圖7 接種與未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物的KEGG富集分析

2.6 ‘蒙農三葉草1號’根系中差異代謝物種類及其數量的變化

對接種與未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中的DAMs進行KEGG化合物分類,發現22種DAMs屬于不同化合物類型,其中有9種DAMs屬于類黃酮類化合物,分別為黃豆黃甙、異鼠李素、黃芪甲素、山奈酚、槲皮素、楊梅素、蟛蜞菊內酯、異山奈和根皮苷,含量均表現為顯著增加;有2種DAMs屬于苯丙素類化合物,分別為香豆素和芥子醇,其中香豆素含量顯著增加,芥子醇含量顯著降低。蜜二糖是唯一的糖類化合物,含量顯著增加。在其余化合物中,除檸檬酸和壬二酸外,其他均表現為含量顯著增加(表3)。

表3 接種與未接種根瘤菌‘蒙農三葉草1號’根系中的主要差異代謝物

2.7 ‘蒙農三葉草1號’根系結瘤關鍵通路中差異代謝物的變化分析

對DAMs的KEGG通路及富集情況進行整理分析,共有16種化合物的含量在TCA循環、苯丙素生物合成和類黃酮生物合成過程中發生變化(圖8)。‘蒙農三葉草1號’接種根瘤菌后,類黃酮生物合成途徑中的根皮苷、山奈酚、槲皮素、楊梅素和黃豆黃甙含量顯著增加。苯丙素生物合成過程中的香豆素和香草醛含量顯著增加,芥子醇含量顯著降低(表4)。‘蒙農三葉草1號’與根瘤菌結合后,酮戊二酸、精氨酸和天冬氨酸含量顯著增加,促進了苯丙素和類黃酮生物合成過程。類黃酮化合物含量增加,促進了‘蒙農三葉草1號’與根瘤菌的相互作用。

表4 接種根瘤菌后‘蒙農三葉草1號’根系結瘤關鍵通路差異代謝物含量變化

圖8 接種根瘤菌后‘蒙農三葉草1號’根系結瘤關鍵通路中差異代謝物的變化

3 討論

‘蒙農三葉草1號’接種根瘤菌后,鑒定到的DAMs主要參與次級代謝產物的生物合成、氨基酸代謝過程、膜運輸和信號轉導過程。ABC-轉運體可以參與植物對細菌的生物脅迫與非生物脅迫的反應,在大豆(GlycinemaxMerr.)中,ABC-轉運體可以參與根系化合物的分泌,在結瘤過程中起到重要的作用[21]。本研究發現,‘蒙農三葉草1號’在結瘤過程中,DAMs在ABC-轉運體通路中顯著富集,說明ABC-轉運體也參與了‘蒙農三葉草1號’結瘤固氮作用。

在植物體三羧酸循環中,酮戊二酸主要參與能量的代謝,是碳氮代謝過程的關鍵調節因子[22],它能反映植物碳氮代謝情況,也是調節信號轉導蛋白和代謝相關酶的信號分子[23]。豆科植物根瘤菌將氮固定成氨的過程是通過谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶催化完成的[24],酮戊二酸可以對硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶和谷氨酰胺合成酶進行催化作用[25],從而促進氮代謝過程。‘蒙農三葉草1號’接種根瘤菌后,酮戊二酸含量顯著增加,意味著根瘤菌促進了‘蒙農三葉草1號’根系酮戊二酸含量的增加,加速了谷氨酰胺合成酶催化作用,促進氮代謝過程。此外,本研究還發現,‘蒙農三葉草1號’接種根瘤菌后,根系中精氨酸含量顯著增加,有可能是由于酮戊二酸促進了氨基酸含量的變化。精氨酸可以貯藏氮素營養,生成的前體物質可以參與植株的生長、抗逆性等生理生化作用,有利于促進豆科植物根瘤的生長[26]。研究發現,植物在缺氮情況下,根系天冬氨酸含量明顯下降[27]。Bacanamwo等[28]認為,根瘤的固氮活性與天冬氨酸有關。本研究中,‘蒙農三葉草1號’根系天冬氨酸含量顯著增加,說明其在接種根瘤菌9 d時,天冬氨酸促進了根瘤菌定殖和結瘤作用。

本研究對接種根瘤菌后的‘蒙農三葉草1號’根系代謝物進行分析,對得到的DAMs進行KEGG化合物分類,共有9種化合物屬于黃酮類化合物。在豆科植物與根瘤菌共生過程中,類黃酮化合物是關鍵的信號分子化合物[20],可以傳導豆科植物早期結瘤信號,并對結瘤基因進行誘導。因此,類黃酮化合物作為宿主特異性固氮共生體,對維持根瘤菌與植物共生至關重要。

類黃酮是植物中苯丙酸代謝和乙酸—丙二酸途徑的次生代謝產物。所有的黃酮類化合物都是莽草酸途徑產生的苯丙氨酸和乙酰輔酶A羧化反應產生的丙二酰輔酶A的衍生物[29]。有研究表明,在接種根瘤菌時添加黃酮誘導劑,可以增加根瘤菌在土壤中的競爭力[30-31]。黃酮類化合物山奈酚和槲皮素受黃酮-3’-羥化酶(F3’H)和黃酮-3’,5’-羥基化酶(F3’5’H)催化,可以生成楊梅素[32]。山奈酚可以作為根瘤菌的誘導劑,誘導根瘤菌定殖在豆科植物根系中[33]。本研究中,接種根瘤菌后,‘蒙農三葉草1號’根系山奈酚、槲皮素和楊梅素含量顯著增加,說明類黃酮化合物山奈酚、槲皮素和楊梅素均在‘蒙農三葉草1號’早期結瘤過程起到了促進作用[34]。

香豆素化合物是植物合成的重要次級代謝物,除了在植物攝取鐵的過程中起作用,還可以作為共生細菌、病原體的信號分子,具有抗菌和抗病毒的特性[35]。有益微生物可以誘導香豆素分泌到植物根際,保護植物免受致病性攻擊[36]。也有研究發現,香豆素會抑制固氮細菌的生長和固氮作用[37]。本研究中,‘蒙農三葉草1號’在接種根瘤菌后,香豆素含量顯著增加,說明在根瘤菌進入根系后觸發了香豆素的保護機制,但后期對結瘤的影響目前還不明確,需要進一步研究。

‘蒙農三葉草1號’在接種根瘤菌后,可能導致TCA循環中酮戊二酸與檸檬酸含量的變化,從而引發部分氨基酸,如精氨酸與天冬氨酸含量的顯著增加。由精氨酸合成的泛酰硫氫乙胺的含量的增加誘導類黃酮生物合成和苯丙素生物合成中的部分黃酮類化合物顯著增加,釋放Nod因子,從而促進根瘤菌的定殖和結瘤過程。

4 結論

本研究首次運用代謝組學測序技術,對‘蒙農三葉草1號’接種根瘤菌后的根系代謝產物進行了分析,共鑒定到249個差異代謝物。其中,精氨酸、天冬氨酸、酮戊二酸、山奈酚、槲皮苷、根皮苷、楊梅素和黃豆黃甙含量顯著增加,促進了‘蒙農三葉草1號’與根瘤菌的結合,這8種代謝物是影響結瘤過程的關鍵代謝物。