干旱脅迫下紫花苜蓿葉片代謝組分析及氣孔調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選

李 樂(lè), 李丹寧, 楊葉研, 潘新雅, 萬(wàn)懿琦, 張國(guó)云, 席杰軍, 王亞芳*, 楊培志*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 陜西 楊凌 712100; 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西 楊凌 712100)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)不僅產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣,而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、固氮效果好,被譽(yù)為“牧草之王”[1-2]。自然環(huán)境下,苜蓿根部與根瘤菌共生固氮,可以將大氣中游離的氮轉(zhuǎn)化為植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的氮素,為苜蓿提供氮肥,減少氮肥大量施加帶來(lái)的污染,研究報(bào)道,增加植物氮肥攝入能提高植物對(duì)干旱等環(huán)境脅迫的抵抗力[3]。另外,苜蓿根系發(fā)達(dá),在改善生態(tài)環(huán)境、水土保持方面也具有天然優(yōu)勢(shì)[4]。

苜蓿是高耗水類(lèi)型牧草,每形成1 g干物質(zhì)需水900～1 000 g[5]。然而,我國(guó)苜蓿種植區(qū)主要分布在西北、華北、東北以及黃淮海等地區(qū),其中70%屬于干旱或半干旱的地區(qū)[6]。雖然苜蓿有一定的抗旱能力,但是在灌溉條件下才能獲得高產(chǎn)量高品質(zhì)苜蓿。我國(guó)是淡水資源緊缺的國(guó)家,隨著全球氣候變暖,土壤和水分環(huán)境逐漸惡化,干旱脅迫也日趨嚴(yán)重[7]。干旱脅迫降低了苜蓿的品質(zhì)及產(chǎn)量,影響了苜蓿的種植分布,是制約紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最主要環(huán)境因子[4,8-9]。

干旱作為一種多維脅迫,能夠引起植物從表型、生理、生化再到分子水平的一系列變化[10]。干旱脅迫首先引起植物葉片細(xì)胞水分虧缺,水分信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锛に孛撀渌?Abscisic aid,ABA)信號(hào)[11],能通過(guò)減小氣孔開(kāi)度的方式以降低干旱導(dǎo)致的葉片蒸騰作用,調(diào)節(jié)植物水分平衡[12]。同時(shí)植物產(chǎn)生復(fù)雜的代謝變化響應(yīng)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡[13],以避免植物水分失衡、代謝紊亂最終導(dǎo)致的萎蔫死亡,其中涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透調(diào)控、激素和次生代謝產(chǎn)物等多種途徑的調(diào)控[14-16]。ABA對(duì)提高植物抗旱能力效果明顯,是重要的抗蒸騰劑或抗旱誘導(dǎo)因子[17-18],ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉是緩解干旱脅迫的重要途徑[15,19]。一方面ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉,提高水分利用效率(WUE:通過(guò)蒸騰作用損失的每單位水所獲取的碳量)[20],減弱蒸騰作用。另一方面,ABA的積累激發(fā)植物的滲透調(diào)節(jié)、抗氧化系統(tǒng)等代謝變化[21],最終緩解植物遭受干旱脅迫引起的滲透脅迫[22-23]與氧化脅迫等代謝功能障礙[17]。因此,ABA是植物應(yīng)答干旱脅迫的重要激素[17],也是有效的抗蒸騰劑[20],另外研究發(fā)現(xiàn)水楊酸鈉(Sodium salicylate,NaSA)、乙烯(Ethylene,ET)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)等代謝物質(zhì)對(duì)氣孔也有調(diào)控作用。然而,對(duì)于干旱脅迫下紫花苜蓿葉片的代謝變化以及外源差異代謝物對(duì)氣孔的調(diào)控作用缺少相關(guān)報(bào)道。因此,本研究闡明干旱脅迫下紫花苜蓿葉片的代謝物變化,從中篩選影響葉片蒸騰和氣孔開(kāi)度的物質(zhì),為開(kāi)發(fā)苜蓿氣孔調(diào)節(jié)物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿‘雷達(dá)克之星’(MedicagosativaL. ‘Ladak+’)和苜蓿專(zhuān)用根瘤菌制劑多萌(Rhizobiummelilotistrain Dormal)購(gòu)買(mǎi)自北京克勞沃種業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)處理

1.2.1種子萌發(fā) 種子萌發(fā)采用暗發(fā)芽。挑選飽滿的紫花苜蓿種子用70%乙醇溶液浸泡消毒15 min,蒸餾水沖洗5次后置于鋪有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中,用錫紙完全包裹培養(yǎng)皿進(jìn)行暗發(fā)芽,4℃春化2 d后置于人工氣候室中(溫度25℃,空氣相對(duì)濕度40%)培養(yǎng)5 d,種子萌發(fā)期間,每隔12 h適當(dāng)補(bǔ)充蒸餾水,以保證濾紙持續(xù)濕潤(rùn)、種子正常吸脹[24]。

1.2.2苜蓿苗期培養(yǎng)與根瘤菌接種 將子葉完全展開(kāi)的健康幼苗移栽到裝有100 目無(wú)菌石英砂的培養(yǎng)缽(高18 cm×上直徑10 cm×下直徑8 cm,已滅菌)中,放置人工氣候室中培養(yǎng),生長(zhǎng)環(huán)境為溫度25℃,空氣相對(duì)濕度40%,16 h光照,光照強(qiáng)度為122.4 μmol·m-2·s-1。為模擬自然狀態(tài)下紫花苜蓿與根瘤菌共生固氮的生長(zhǎng)狀態(tài),苜蓿移栽后7 d(苜蓿幼苗生長(zhǎng)約3 cm)接種一次根瘤菌,30 d二次接種根瘤菌。每天澆灌無(wú)氮Hoagland營(yíng)養(yǎng)液以激活根瘤固氮作用[24-25]。生長(zhǎng)期間在60 d刈割一次,苜蓿培養(yǎng)至90 d進(jìn)行干旱處理,此時(shí)苜蓿根部形成具有固氮活性的粉紅色根瘤[26-27]。

1.2.3苜蓿干旱處理 采用埋干砂脫水法對(duì)苜蓿進(jìn)行模擬干旱處理。以前期研究[28]為依據(jù),采用0 h,3 h,8 h埋干砂脫水處理模擬干旱脅迫前(D0),輕度干旱(D1),重度干旱(D2)。待苜蓿生長(zhǎng)至90 d,將苜蓿盡量無(wú)損傷地從培養(yǎng)缽中拔出,然后將根部的沙子用緩流水沖洗干凈,根部輕柔地包裹在吸水紙(18 cm×18 cm)中吸干水分(此時(shí)為D0的采樣時(shí)間點(diǎn)),將D1,D2處理組的苜蓿根部放入培養(yǎng)缽并將其裝滿無(wú)菌100目干燥石英砂,分別進(jìn)行3 h,8 h的脫水處理,并且在脫水脅迫后3 h(D1),8 h(D2)采樣。

在每個(gè)處理組中隨機(jī)選取3株苜蓿葉片混合成1個(gè)重復(fù),每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)處理組15株苜蓿。將采集的苜蓿葉片迅速放入液氮中,所有樣品均保存在—80℃,用于葉片代謝組檢測(cè)。

1.3 苜蓿葉片代謝組測(cè)定

通過(guò)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)方法分析對(duì)苜蓿葉片進(jìn)行廣泛非靶向代謝組鑒定。代謝組檢測(cè)方法采用Waters ACQUITY超高效液色譜(UPLC)和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精確質(zhì)譜儀,該質(zhì)譜儀與加熱電噴霧電離(HESI-II)源和Orbitrap質(zhì)譜儀連接,以35 000質(zhì)量分辨率運(yùn)行。將樣品提取物干燥,然后按照以下四種方法的需要準(zhǔn)備樣品溶液,準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品以確保注射和色譜一致性。(1)第一份等分試樣使用酸性正離子條件分析,色譜優(yōu)化以獲得更多親水性化合物。在該方法中,使用含有0.05%全氟辛酸(PFPA)和0.1%甲酸(FA)的水和甲醇從C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1 mm×100 mm,1.7 μm)梯度洗脫提取物。(2)第二份等分試樣使用酸性正離子條件進(jìn)行分析,并且對(duì)其進(jìn)行色譜優(yōu)化,以獲得更疏水的化合物。在該方法中,使用甲醇、乙腈、水、0.05% PFPA和0.01% FA從上述相同的C18柱梯度洗脫提取物,并在總體較高的有機(jī)含量下操作。(3)第三份等分試樣使用基本負(fù)離子優(yōu)化條件分析,使用甲醇和水以及pH為8.0的6.5 mmol·L-1碳酸氫銨從單獨(dú)的專(zhuān)用C18柱中梯度洗脫堿性提取物。(4)第四份等分試樣通過(guò)負(fù)電離分析。使用由水和乙腈與10 mmol·L-1甲酸銨(pH 10.8)組成的梯度,從HILIC柱(Waters UPLC BEH Amide 2.1 mm×150 mm,1.7 μm)洗脫提取物。

1.4 外源施加差異代謝物

通過(guò)外源施加差異代謝物,測(cè)定苜蓿離體葉片的蒸騰量和氣孔開(kāi)度,快速探索代謝組篩選的差異代謝物對(duì)氣孔開(kāi)閉的影響。測(cè)定的差異代謝物有:脫落酸、棉子糖(Raffinose,RAF)、維生素B6(Pyridoxate,VB6)、煙酰胺(Nicotinamide,VB3)、脫氫抗壞血酸(Dehydroascorbate,DHA)、熊果苷(Hydroquinone beta-D-glucopyranoside,Arb)、組氨酸(Histidine,His)和脯氨酸(Proline,Pro)。苜蓿生長(zhǎng)至90 d左右(方法同1.2.1和1.2.2),在試驗(yàn)前2～3 h確保充足水分供給,選擇苜蓿頂端向下完全展開(kāi)的第3～6片完整復(fù)葉,在水中剪取以防止在小葉柄處產(chǎn)生氣泡,迅速轉(zhuǎn)移到盛滿水的圓錐體塑料小容器中(高3.3 cm×上直徑6.2 cm×下直徑5 cm),容器頂部用塑料膜密封,塑料膜上扎6個(gè)小孔,并將合適孔徑的槍頭插在小孔中以支撐苜蓿葉柄,使苜蓿葉片完全展開(kāi)并立于小容器內(nèi)。將裝載好的葉片放置在恒溫恒濕無(wú)風(fēng)的試驗(yàn)條件(光照強(qiáng)度為122.4 μmol·m-2·s-1,濕度40%,溫度25℃)下3 h使氣孔完全打開(kāi)(采用顯微鏡觀察測(cè)定),再將葉片轉(zhuǎn)移到裝有代謝組篩選的差異代謝物溶液的容器中進(jìn)行蒸騰量測(cè)定和電鏡取樣。

1.5 苜蓿葉片蒸騰量測(cè)定

根據(jù)以下公式計(jì)算單位葉面積的蒸騰量(Transpiration),每個(gè)處理的苜蓿總面積為18個(gè)小葉片的掃描面積(每個(gè)處理6個(gè)復(fù)葉,剪去復(fù)葉小葉柄),剪取小葉片平置在A4紙上,用透明文件夾(帶有標(biāo)尺)夾住,放置在掃描儀中掃描葉片圖像,后用ImageJ測(cè)量葉面積。

(1)

式中,Tn是試驗(yàn)第1,2,3,4 h時(shí)刻測(cè)定的單位葉面積蒸騰量(μg·cm-2);Mn是蒸騰測(cè)定1,2,3,4 h后的稱(chēng)重量;M0是裝載6個(gè)葉片和處理液的裝置的初始稱(chēng)重量;LA指每個(gè)處理(6個(gè)葉片)的總?cè)~面積。

1.6 苜蓿葉片氣孔開(kāi)度的觀測(cè)

1.6.1電鏡生物樣品制作 取經(jīng)過(guò)外源差異代謝物處理4 h(同1.4)的苜蓿葉片,置于預(yù)冷的4%戊二醛溶液中,4℃過(guò)夜固定,經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水,丙酮置換浸透放入二氧化碳臨界點(diǎn)干燥儀中進(jìn)行干燥,粘臺(tái)噴金后,在S-4800掃描電鏡下觀察葉片表皮氣孔形態(tài)特征,選取3 500倍及500倍視野照相。每片葉隨機(jī)觀察5個(gè)視野,每個(gè)處理重復(fù)5次。

1.6.2氣孔開(kāi)度測(cè)定 觀察500 倍電鏡視野范圍內(nèi)的氣孔開(kāi)度,用imageJ隨機(jī)測(cè)量每個(gè)處理的30個(gè)細(xì)胞的氣孔長(zhǎng)和寬,按照電鏡視野標(biāo)尺的大小換算出實(shí)際氣孔的數(shù)值,將氣孔開(kāi)度定義為寬/長(zhǎng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)及分析

使用Metabolon的硬件和軟件提取代謝組原始數(shù)據(jù),采用(FDR)計(jì)算統(tǒng)計(jì)顯著性(P值),P<0.05,P<0.01的代謝物被認(rèn)為是不同比較組間的顯著,極顯著的差異代謝物,后續(xù)進(jìn)行主成分分析(PCA)、維恩圖(venny3.1.0)等統(tǒng)計(jì)分析。

利用照度計(jì)TES1330A測(cè)量光照強(qiáng)度,采用掃描儀(SONY FDR-AX60)掃描葉片圖像,利用ImageJ測(cè)量軟件測(cè)定葉面積、氣孔開(kāi)度,用SPSS 24分析軟件進(jìn)行單因素方差分析,多重比較采用LSD檢驗(yàn),采用Excel整理數(shù)據(jù)、做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿葉片代謝組分析

2.1.1樣本質(zhì)控分析 對(duì)不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片進(jìn)行廣泛非靶向代謝組檢測(cè)。依據(jù)紫花苜蓿葉片代謝組主成分分析(PCA)可知(圖1),主成分1和主成分2能夠?qū)⒉煌潭鹊母珊堤幚斫M分開(kāi),說(shuō)明干旱脅迫引起苜蓿葉片代謝組發(fā)生變化;而每個(gè)處理的5個(gè)重復(fù)聚成一簇,說(shuō)明樣品的重復(fù)性較好。

圖1 不同程度干旱脅迫下紫花紫花苜蓿葉片主成分分析(PCA)

2.1.2干旱脅迫下苜蓿葉片代謝物變化 代謝組檢測(cè)出211種代謝物,分為以下8類(lèi)(圖2):氨基酸類(lèi)(Amino acid)(68種,32.23%),脂類(lèi)(Lipids)(44種,20.85%),糖類(lèi)(Carbohydrate)(43種,20.38%),核苷酸類(lèi)(Nucleotide)(16種,7.58%),輔因子、輔基、電子載體類(lèi)(Cofactorsor Prosthetic Groups or Electron Carriers)(15種,7.11%),肽類(lèi)(Peptide)(12種,5.69%),次生代謝類(lèi)(Biosynthesis of secondary metabolites)(11種,5.21%),激素代謝類(lèi)(Hormone metabolites)(2種,0.95%)。

圖2 不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片代謝組鑒定出的代謝物分類(lèi)

對(duì)211個(gè)代謝物依據(jù)P<0.05篩選出99個(gè)差異代謝物。與輕度干旱(D1)相比,重度干旱(D2)脅迫下鑒定出更多的差異代謝物,且干旱脅迫下含量升高的(上調(diào))差異代謝物數(shù)量高于含量降低的(下調(diào))差異代謝物(表1)。

表1 不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片差異代謝物數(shù)量

代謝途徑分析表明,這些差異代謝物參與了苜蓿葉片的碳氮代謝。光呼吸(Photorespiration)是植物碳氮代謝的重要過(guò)程,而光呼吸的碳主要以氨基酸的方式輸出。氨基酸代謝是干旱脅迫下苜蓿葉片中產(chǎn)生差異代謝物質(zhì)最多的途徑(圖3),83%的氨基酸顯著上調(diào)(P<0.05),大量氨基酸積累,其中絲氨酸(Serine)、組氨酸等物質(zhì)的含量隨著干旱脅迫程度的加深不斷升高。

圖3 不同程度干旱脅迫下紫花苜蓿葉片差異代謝物分類(lèi)

干旱導(dǎo)致植物體糖酵解(Lycolysis,EMP)水平降低,糖酵解途徑的關(guān)鍵物質(zhì)葡萄糖(Glucose)、6-磷酸葡萄糖(Glucose-6-phosphate,G6P)、丙酮酸鹽(Pyruvate)的含量均顯著降低(P<0.05)(圖3)。因此,干旱脅迫引起了苜蓿葉片的“碳饑餓”。干旱脅迫下,氨同化代謝(Ammonia assimilation metabolism)的關(guān)鍵代謝物質(zhì)谷氨酰胺(Glutamine)、脯氨酸以及鳥(niǎo)氨酸(Ornithine)含量顯著上調(diào)(P<0.05),說(shuō)明干旱脅迫加劇植物體內(nèi)氨同化途徑代謝。代謝產(chǎn)物鳥(niǎo)氨酸上調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致多胺(Polyamines,PA)物質(zhì)精氨酸(Arginine)和5′-甲硫基腺苷(5′-methylthio adenosine,MTA)含量顯著上調(diào)(P<0.05)。干旱脅迫下苜蓿葉片的氮積累增加。因此,干旱脅迫引起苜蓿葉片中糖酵解、碳反應(yīng)(Calvin cycle)水平降低,氨同化和多胺水平上升,從而導(dǎo)致碳氮代謝失衡。

干旱引起苜蓿葉片激素含量變化。輕度(D1)、重度干旱(D2)處理下,苜蓿葉片中脫落酸鹽均顯著上調(diào)(P<0.05),說(shuō)明干旱脅迫誘導(dǎo)ABA含量的積累。愈傷酸(Traumatic acid,TA)是植物體內(nèi)由磷脂類(lèi)(Phospholipids)產(chǎn)生的一種非生物脅迫應(yīng)激反應(yīng)激素,其含量在干旱脅迫下不斷積累,在重度干旱處理下達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

干旱脅迫下,植物葉片谷胱甘肽循環(huán)(GSH Cycle)以及抗氧化物質(zhì)含量增加,以緩解干旱脅迫引起的氧化損傷。GSH代謝中的關(guān)鍵物質(zhì)5-氧代脯氨酸(5-oxoproline)、絲氨酸上調(diào),乙酰絲氨酸(O-acetyl-serine)顯著下調(diào)(P<0.05),說(shuō)明干旱脅迫下谷胱甘肽循環(huán)加劇。另外,干旱引起苜蓿葉片中維生素E(Alpha-tocopherol)、脫氫抗壞血酸、VB6等抗氧化劑顯著上調(diào)(P<0.05)。

干旱脅迫下,棉子糖家族低聚糖(RFOs)代謝增強(qiáng)以緩解干旱脅迫引起的滲透脅迫。干旱脅迫導(dǎo)致苜蓿葉片中大部分的糖類(lèi)物質(zhì)含量顯著上調(diào)(P<0.05)(圖3),RFOs包括甜菜苷(Galactinol)、棉子糖(Raffinose)、山梨醇(Sorbitol)含量顯著上調(diào)(P<0.05),肌醇(Myo-inositol)含量顯著上調(diào)(P<0.05),說(shuō)明干旱脅迫下,植物細(xì)胞不斷積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)保持膨壓維持細(xì)胞活性和膜運(yùn)輸?shù)恼＿\(yùn)轉(zhuǎn),提高植物抗性。然而,這些RFOs的積累是以降低其它碳循環(huán)的關(guān)鍵物質(zhì)含量為代價(jià)的,例如糖酵解途徑的葡萄糖(Glucose)、G6P(Glucose 6-phosphate)、草酰乙酸途徑的天冬氨酸(Aspartate)、谷胱甘肽循環(huán)的甜菜堿(Betaine)、碳反應(yīng)中的關(guān)鍵代謝物甘油酸鹽(Glycerate)等含量的顯著降低(P<0.05)。

總之,干旱脅迫引起苜蓿葉片中碳缺乏、氮積累繼而導(dǎo)致碳氮代謝失衡;干旱脅迫引起苜蓿葉片中ABA、愈傷酸的含量顯著增加,并隨著脅迫程度的加深而加劇(P<0.05);干旱脅迫增強(qiáng)苜蓿葉片中谷胱甘肽循環(huán),促進(jìn)棉子糖家族低聚糖(RFOs)明顯積累,從而提高苜蓿的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力。

2.2 外源施加差異代謝物對(duì)苜蓿葉片蒸騰和氣孔開(kāi)度的影響

依據(jù)代謝物的理化性質(zhì)和在干旱脅迫下的含量變化,并通過(guò)文獻(xiàn)查閱這些代謝物對(duì)植物的作用,本研究初步篩選了顯著變化的差異代謝物質(zhì)(脫落酸、棉子糖、VB6、煙酰胺、脫氫抗壞血酸、熊果苷、組氨酸和脯氨酸),通過(guò)分析外源施加以上差異代謝物對(duì)離體苜蓿葉片的蒸騰量和氣孔開(kāi)度的影響,篩選紫花苜蓿的氣孔調(diào)節(jié)物質(zhì)。

2.2.1ABA對(duì)苜蓿葉片蒸騰和氣孔開(kāi)度的影響 代謝組結(jié)果顯示,輕度和重度干旱脅迫下植物激素ABA含量顯著增加,分別對(duì)照組的3.80和4.55倍(圖3)。因此,本研究首先分析了外源施加ABA對(duì)苜蓿葉片單位面積蒸騰量和氣孔開(kāi)度的影響。

隨著外源施加ABA濃度的增大,苜蓿葉片單位面積蒸騰量逐漸減小,并隨著處理時(shí)間的增加更為明顯(圖4)。ABA濃度達(dá)到0.05 μmol·L-1時(shí),苜蓿葉片蒸騰量顯著低于對(duì)照組(CK,蒸餾水)(P<0.05);ABA濃度達(dá)到0.1 μmol·L-1時(shí),葉片蒸騰量顯著低于CK及0.05 μmol·L-1ABA處理(P<0.05)。

圖4 外源施加脫落酸(ABA)對(duì)紫花苜蓿離體葉片的蒸騰量的影響

隨著外源施加ABA濃度的增大,苜蓿葉片氣孔逐漸關(guān)閉(圖5a)。外源施加ABA濃度達(dá)到0.05 μmol·L-1時(shí),葉片氣孔明顯關(guān)閉,氣孔開(kāi)度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖5b)。外源施加ABA濃度達(dá)到0.1 μmol·L-1時(shí),氣孔幾乎完全關(guān)閉,氣孔開(kāi)度與CK,0.05 μmol·L-1ABA處理均有顯著差異(P<0.05)。因此,外源施加ABA能夠誘導(dǎo)苜蓿氣孔關(guān)閉,降低葉片單位面積蒸騰量。

2.2.2棉子糖協(xié)同ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉 輕度和重度干旱脅迫下的紫花苜蓿對(duì)比對(duì)照組,葉片中的棉子糖含量分別提高了5.37和8.28倍(圖3),然而外源施加1 μmol·L-1或1 mmol·L-1RAF 4 h后,單位面積葉片的蒸騰量與對(duì)照均無(wú)顯著差異,說(shuō)明外源施加RAF對(duì)苜蓿葉片蒸騰量無(wú)顯著影響(圖6)。然而,掃描電鏡結(jié)果顯示,外源施加 1 mmol·L-1RAF時(shí),葉片氣孔開(kāi)度顯著降低(P<0.05)(圖7),表明1 mmol·L-1RAF具有促進(jìn)葉片氣孔關(guān)閉的作用,但其促進(jìn)氣孔關(guān)閉的效果低于0.05 μmol·L-1ABA。

圖6 外源施加棉子糖(RAF)對(duì)紫花苜蓿離體葉片的蒸騰量的影響

圖7 外源施加棉子糖(RAF)對(duì)紫花苜蓿離體葉片氣孔開(kāi)度的影響

為了闡明RAF是否能夠協(xié)同ABA促進(jìn)氣孔的關(guān)閉的作用,測(cè)定了外源同時(shí)施加RAF和ABA對(duì)葉片蒸騰量及氣孔開(kāi)度的影響。結(jié)果表明,外源同時(shí)施加1 mmol·L-1RAF和0.05 μmol·L-1ABA 3 h后,葉片蒸騰量顯著低于0.05 μmol·L-1ABA(P<0.05)(圖6)。掃描電鏡結(jié)果顯示,外源同時(shí)施加RAF和ABA時(shí),苜蓿葉片氣孔完全關(guān)閉,氣孔開(kāi)度顯著低于單獨(dú)施加ABA與單獨(dú)施加1 mmol·L-1的RAF(P<0.05)。因此,RAF促進(jìn)了ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。

2.2.3VB6抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉 輕度和重度干旱脅迫下的紫花苜蓿對(duì)比對(duì)照組,葉片中的VB6含量分別提高了1.89和2.71倍(圖3),然而外源施加1 μmol·L-1,10 μmol·L-1VB64 h后,單位面積葉片的蒸騰量與對(duì)照均無(wú)顯著差異,說(shuō)明外源施加VB6對(duì)苜蓿葉片蒸騰量無(wú)顯著影響(圖8)。掃描電鏡結(jié)果表明,外源施加10 μmol·L-1VB6時(shí),葉片氣孔開(kāi)度顯著高于對(duì)照(P<0.05)(圖9),表明VB6具有促進(jìn)苜蓿葉片氣孔打開(kāi)的作用。

圖8 外源施加維生素B6(VB6)對(duì)紫花苜蓿離體葉片蒸騰量的影響

圖9 外源施加維生素B6 (VB6)對(duì)紫花苜蓿離體葉片氣孔開(kāi)度的影響

外源同時(shí)施加10 μmol·L-1VB6和0.1 μmol·L-1ABA時(shí),葉片蒸騰量顯著高于單獨(dú)施加0.1 μmol·L-1ABA(P<0.05)。掃描電鏡結(jié)果表明同時(shí)施加VB6和ABA時(shí),氣孔開(kāi)度顯著大于單獨(dú)施加ABA處理(P<0.05)。因此,外源施加VB6能夠抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,增加氣孔開(kāi)度,提高葉片的蒸騰量。

通過(guò)對(duì)苜蓿離體葉片外源施加差異代謝物質(zhì)發(fā)現(xiàn),外源ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉;外源RAF能夠促進(jìn)氣孔關(guān)閉,與ABA具有協(xié)同作用;外源VB6能夠促進(jìn)氣孔打開(kāi),抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。此外,我們還分析了外源施加其它差異代謝物質(zhì)對(duì)苜蓿葉片單位面積蒸騰量的影響,發(fā)現(xiàn)煙酰胺、熊果苷、脫氫抗壞血酸、脯氨酸、組氨酸等對(duì)苜蓿離體葉片蒸騰量無(wú)顯著影響。

3 討論

研究表明,干旱脅迫下,植物產(chǎn)生復(fù)雜的代謝動(dòng)態(tài)響應(yīng),以減少水分散失來(lái)維持植物的生長(zhǎng)發(fā)育[14,16],其中涉及激素代謝、碳氮代謝、RFOs積累及其它物質(zhì)代謝、滲透調(diào)節(jié)等多種途徑的調(diào)控[12,15]。本研究結(jié)果顯示,在干旱脅迫下,紫花苜蓿葉片中大量代謝物積累,引起碳代謝相關(guān)的糖酵解水平降低、碳反應(yīng)減弱,氮代謝相關(guān)的氨同化代謝加劇、多胺水平上升,導(dǎo)致植物體內(nèi)碳氮代謝失衡,這與以往研究一致[12,14-16]。干旱脅迫下,植物的生存和生長(zhǎng)均依賴于葉片氣孔對(duì)碳獲取和蒸騰的調(diào)控[29],其中植物維持碳平衡的能力與代謝物含量的變化相關(guān)[30]。研究表明,脫落酸[22-23]等激素、脯氨酸[25]等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能提高苜蓿抗旱能力[12],本研究結(jié)果顯示,干旱脅迫下,紫花苜蓿葉片中ABA、愈傷酸等激素含量,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(棉子糖、脯氨酸等)以及抗氧化物質(zhì)(VB6等)不斷積累,對(duì)提高苜蓿的抗旱能力積極作用。

干旱誘導(dǎo)ABA積累調(diào)控植物氣孔開(kāi)度以減少水分蒸騰從而提高植物抗旱性[10]。大量的分子生物學(xué)和生理學(xué)研究已經(jīng)闡明了ABA調(diào)控氣孔開(kāi)閉的機(jī)制[31]。研究表明,氣孔運(yùn)動(dòng)實(shí)際上可能由抗逆誘導(dǎo)因子ABA[17-18]與多種物質(zhì)例如赤霉素(Gibberellin,GA)、乙烯、水楊酸等共同控制[32-33],而干旱引起的差異代謝物質(zhì)與ABA在調(diào)控氣孔方面是否有關(guān)系值得討論。本研究探討了苜蓿葉片中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)RAF、脯氨酸以及抗氧化物質(zhì)VB6等在干旱脅迫下顯著積累的差異代謝物對(duì)苜蓿葉片蒸騰和氣孔開(kāi)度的影響及其與ABA的關(guān)系。植物在干旱脅迫下積累各種有機(jī)物質(zhì)、無(wú)機(jī)物質(zhì),調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝物質(zhì)的變化以降低細(xì)胞滲透勢(shì)即滲透調(diào)節(jié),緩解細(xì)胞滲透壓失衡導(dǎo)致的代謝活動(dòng)紊亂[34-36],對(duì)于保持植物葉片的含水量,保持膨壓,維持細(xì)胞活性和膜運(yùn)輸?shù)恼＿\(yùn)轉(zhuǎn),在維持氣孔開(kāi)度、穩(wěn)定光合速率以及保持細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)有重要作用[37-38],本研究結(jié)果顯示,苜蓿葉片不斷積累脯氨酸、棉子糖、甜菜堿等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以緩解干旱導(dǎo)致的滲透脅迫。代謝組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),干旱脅迫下,紫花苜蓿葉片中多種RFOs物質(zhì)含量升高,且重度干旱下RFOs含量升高較輕度干旱更為顯著。研究表明,RFOs是植物體在脅迫下產(chǎn)生的一類(lèi)不影響細(xì)胞正常代謝過(guò)程的保護(hù)性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[34],同時(shí)RFOs也參與了碳的運(yùn)輸和儲(chǔ)存[38],RFOs物質(zhì)的積累不僅參與苜蓿葉片的滲透調(diào)節(jié),而且可能與緩解干旱導(dǎo)致的碳氮代謝失衡有關(guān)。研究表明,棉子糖是RFOs中的一種功能性低聚糖,普遍存在于所有植物中,在干旱脅迫下迅速積累[34]。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示,外源RAF能夠促進(jìn)苜蓿葉片氣孔關(guān)閉,并且與ABA具有協(xié)同作用。研究表明,在干旱脅迫下,植物體內(nèi)過(guò)度產(chǎn)生活性氧(ROS),對(duì)植物造成氧化應(yīng)激,從而破壞植物的光合機(jī)制[13],而植物體內(nèi)的谷胱甘肽循環(huán)加劇、抗氧化物積累能夠緩解干旱脅迫引起的氧化損傷[39-41],本試驗(yàn)的結(jié)果顯示,苜蓿葉片中谷胱甘肽循環(huán)加劇,VB6積累等抗氧化物質(zhì)積累,其中VB6是植物中的有效抗氧化劑,其抗氧化活性甚至高于維生素C或E[42],VB6還是氨基酸生物合成中的重要輔因子[43],在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)干旱脅迫起著重要作用[24,44-45],同時(shí)VB6與ABA途徑以及氮代謝之間還存在重要聯(lián)系[45-46],因此VB6不僅參與苜蓿葉片的抗氧化,而且可能與ABA途徑調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)緊密相關(guān)[45]。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示,VB6含量隨著干旱脅迫程度的加深不斷積累,而且外源VB6能夠促進(jìn)苜蓿葉片氣孔打開(kāi),抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉,與ABA有拮抗作用。本研究以干旱脅迫下苜蓿葉片代謝組分析為基礎(chǔ),進(jìn)一步證實(shí)差異代謝物質(zhì)RAF,VB6在氣孔調(diào)控方面有不同作用,并且與ABA有關(guān),對(duì)提高苜蓿抗旱性研究提供了一些思考,然而,RAF和VB6調(diào)控苜蓿氣孔的機(jī)制尚不清楚,對(duì)于氣孔調(diào)節(jié)劑的開(kāi)發(fā)缺乏更加深入的產(chǎn)品研究及推廣實(shí)踐。

4 結(jié)論

干旱脅迫引起紫花苜蓿葉片碳氮代謝失衡,脫落酸、愈傷酸含量顯著增加,并隨著脅迫程度的加深而加劇;干旱脅迫增強(qiáng)谷胱甘肽循環(huán),促進(jìn)棉子糖家族低聚糖(RFOs)等物質(zhì)明顯積累,從而提高苜蓿的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力。外源棉子糖能夠促進(jìn)紫花苜蓿葉片氣孔關(guān)閉,并且棉子糖與脫落酸具有協(xié)同作用,能夠促進(jìn)脫落酸誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉;維生素B6能夠促進(jìn)氣孔打開(kāi),并且維生素B6與脫落酸具有拮抗作用,能夠抑制脫落酸誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。