假儉草R2R3-MYB基因家族的鑒定及其在干旱脅迫下的表達(dá)模式分析

蔣宇佳, 于元平, 孫向一, 周 敏, 吳春妍, 李玉華, 劉明稀*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系, 湖南 長沙 410128; 2. 湖南省草地研究中心, 湖南 長沙 410128)

轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子,至少包括4個離散結(jié)構(gòu)域,即DNA結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、核定位信號區(qū)和寡聚化位點,這些結(jié)構(gòu)域共同調(diào)節(jié)許多生理生化過程,并響應(yīng)內(nèi)源性和外源性刺激激活和/或抑制轉(zhuǎn)錄[1]。根據(jù)不同的DNA結(jié)構(gòu)域,轉(zhuǎn)錄因子被分為多個不同的基因家族,常見的轉(zhuǎn)錄因子有MYB,WRKY,NAC,bHLH,bZIP等,其中MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。

MYB轉(zhuǎn)錄因子具有保守的MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域通常含有1～4個約51～52個氨基酸的不完全重復(fù)序列(R1,R2,R3),每個不完全重復(fù)序列由3個α-螺旋編碼,第2和第3個螺旋之間形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)[2-4]。根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和分布位置,一般分為4個亞類,分別為1R-MYB,R2R3-MYB,3R-MYB和4R-MYB,其中2R-MYB數(shù)量居多。1982年從禽類骨髓母細(xì)胞瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的原癌基因v-MYB是最早的MYB轉(zhuǎn)錄因子[5],之后在各種真核生物中發(fā)現(xiàn)了MYB相關(guān)基因家族的存在[2,6]。MYBC1是第一個在植物——玉米(Zeamays)中發(fā)現(xiàn)的MYB轉(zhuǎn)錄因子,其功能與花青素的合成密切相關(guān)[7]。隨后,越來越多的MYB基因在不同植物物種中被鑒定,包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)[8]、水稻(Oryzasativa)[9]、大豆(Glycinemax)[10]、柑橘(Citrus)[11]、油桐(Verniciafordii)[12]、辣椒(Capsicumannuum)[13]等。

R2R3-MYB蛋白是植物MYB轉(zhuǎn)錄因子中存在最為廣泛的一類,被證明與調(diào)節(jié)異丙醇和類黃酮途徑[14-15],植物組織生長發(fā)育[16],激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17],以及響應(yīng)生物和非生物脅迫[18-20]等的反應(yīng)相關(guān)。例如,在Mehrtens等[21]的研究中發(fā)現(xiàn),AtMYB12通過轉(zhuǎn)錄激活CHS和FLS對黃酮醇生物合成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;AtMYB96介導(dǎo)的ABA信號通過誘導(dǎo)水楊酸(SA)的生物合成來增強(qiáng)植物對丁香假單胞菌的抗性[22];在擬南芥中過表達(dá)AtMYB15可能通過提高參與ABA生物合成和信號傳導(dǎo)的基因以及編碼應(yīng)激保護(hù)蛋白的基因的表達(dá)水平來提高其抗旱性和耐鹽性[23]。PtoMYB170正向調(diào)控楊樹(Populustomentosa)成木過程中木質(zhì)素沉積,還可以通過氣孔的關(guān)閉來提高植物的抗旱能力[24];PtoMYB142可直接與蠟生物合成基因(如CER4和KCS6)的啟動子結(jié)合并誘導(dǎo)其表達(dá),導(dǎo)致楊樹葉片中蠟積累量增加,增強(qiáng)抗旱性[25]。同樣,OsMYB60通過促進(jìn)葉表面角質(zhì)層蠟的生物合成來增強(qiáng)水稻對干旱脅迫的適應(yīng)能力[26]。

假儉草[Eremochloaophiuroides(Munro.)]是一種多年生暖季型草坪草,是禾本科蜈蚣草屬中唯一可以用作草坪草的種,被稱為“中國草坪草”[27-28],廣泛分布于美國南部和東部、東南亞以及澳大利亞北部和東部熱帶地區(qū)[29]。有植株低矮、生長緩慢、耐貧瘠、抗病蟲性強(qiáng)、耐粗放管理的特點,能以低成本的養(yǎng)護(hù)管理獲得較高質(zhì)量的草坪,是綠化建設(shè)的優(yōu)良材料[30-32]。假儉草的抗旱能力在暖季型草中屬于中等[31],提高假儉草的抗旱性可進(jìn)一步擴(kuò)大該草種的使用范圍。MYB基因家族廣泛存在于高等植物中,但目前,假儉草MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族鑒定及生物學(xué)功能尚未見報道。因此本研究基于假儉草在不同程度干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過生物信息學(xué)方法系統(tǒng)鑒定了假儉草R2R3-MYB基因家族成員,并對其進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析、蛋白高級結(jié)構(gòu)分析、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析和順式作用元件分析,為深入研究R2R3-MYB基因在假儉草抗旱方面所發(fā)揮的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 假儉草MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定

從已發(fā)表的文獻(xiàn)中獲取假儉草基因組數(shù)據(jù)[33],同時在planttfdb數(shù)據(jù)庫(http://planttfdb.gao-lab.org/)下載擬南芥MYB基因家族蛋白序列。以隱馬爾可夫模型(HMM)為基礎(chǔ),在Pfam數(shù)據(jù)庫下載MYB DNA結(jié)構(gòu)域PF00249。利用HMM軟件,以PF00249為模型,初步篩選假儉草基因組的MYB候選基因;將擬南芥MYB基因蛋白序列作為查詢序列,進(jìn)行本地blast,再次鑒定假儉草基因組的MYB候選基因。然后將兩次篩選獲得的候選基因提交到NCBI中的Batch CD-search中,刪除不含整個MYB保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列,最終得到假儉草MYB基因家族成員。

1.2 假儉草R2R3-MYB基因家族蛋白理化性質(zhì)

利用TBtools中Protein Paramter Calc(ProtParam-based)預(yù)測R2R3-MYB基因編碼蛋白理化性質(zhì);利用在線工具WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測;通過TMHMM Server v2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)網(wǎng)站分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)。

1.3 假儉草R2R3-MYB家族蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)網(wǎng)站預(yù)測假儉草R2R3-MYB家族蛋白的二級結(jié)構(gòu);利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)軟件預(yù)測并建構(gòu)出候選蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.4 假儉草R2R3-MYB基因家族染色體定位

從假儉草基因組數(shù)據(jù)庫注釋文件中獲取假儉草MYB轉(zhuǎn)錄因子在染色體上的位置信息,并進(jìn)行統(tǒng)計整理。然后將假儉草MYB轉(zhuǎn)錄因子上的起始和終止位置信息以及假儉草染色體全長信息提交到在線分析工具M(jìn)G2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制染色體定位模式圖。

1.5 假儉草R2R3-MYB系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA7.0中的ClustalW工具,將鑒定出的假儉草以及擬南芥R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行多重序列比對后,然后用MEGA7.0中的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,選擇Bootstrap method進(jìn)行1000次重復(fù),并利用在線工具EvolView(https://www.evolgenius.info/evolview-v2/#login)對進(jìn)化樹美化。此外,按照擬南芥MYB家族成員亞組分類對系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分組。

1.6 假儉草R2R3-MYB蛋白保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

將假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列提交到在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme),得到MYB蛋白序列的保守基序結(jié)果圖,將motif的最大數(shù)值設(shè)為10,最后用TBtools(Gene structure view)進(jìn)行可視化。

利用假儉草MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因注釋信息gtf文件,分析MYB家族的基因結(jié)構(gòu),并利用TBtools(Gene structure view)進(jìn)行可視化。

1.7 假儉草R2R3-MYB基因家族順式作用元件分析

利用TBtools(gtf/gff3 Sequences Extract)工具截取假儉草R2R3-MYB基因家族成員上游2000bp序列,并上傳到PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站對順式作用元件進(jìn)行分析,最后將分析結(jié)果用TBtools(Simple Biosequence View)進(jìn)行可視化。

1.8 假儉草R2R3-MYB基因在干旱脅迫下的表達(dá)水平分析

本研究在課題組前期獲得的假儉草野生型和突變體的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,分析了EoMYBs基因在假儉草野生型和突變體的不同組織(根、葉)的不同處理時間,分別為干旱處理后第 0(干旱前期)、7(干旱中期)、15(干旱后期)天的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)(干旱取樣時間點的設(shè)置依據(jù)詳情見文獻(xiàn)[34]),并以|Log2(fold change)|≥1,FDR<0.01作為篩選條件,篩選差異表達(dá)的EoMYBs基因,獲取代表EoMYBs基因表達(dá)水平的Log2-transform(FPKM)值,然后利用Tbtools(heatmap)軟件,根據(jù)FPKM值繪制了EoMYBs基因在干旱前期、干旱中期和干旱后期處理下的表達(dá)模式熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 假儉草R2R3-MYB基因家族的鑒定

從假儉草基因組中得到211個MYB成員,將這些序列根據(jù)結(jié)構(gòu)域類型進(jìn)行分類,其中1R-MYB類型94個,R2R3-MYB類型113個,3R-MYB類型4個。鑒于R2R3-MYB在植物轉(zhuǎn)錄因子功能研究中的重要作用,本研究以113個2R-MYB轉(zhuǎn)錄因子作為研究對象,參考染色體定位結(jié)果,分別編號為EoMYB1～EoMYB113。

2.2 假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過TBtools軟件分析得到的假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因信息分析見表1。由表1可知,假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的大小和氨基酸數(shù)目差異很大,其長度為206(EoMYB34)～984 aa(EoMYB41),平均長度為337 aa;蛋白相對分子質(zhì)量為22.46 kD(EoMYB34)～110.32 kD(EoMYB41),平均相對分子質(zhì)量為36.61 kD;等電點為4.6(EoMYB32)～11.63(EoMYB66),其中等電點大于7的假儉草R2R3-MYB蛋白有52個,偏堿性,其余的61個小于7,偏酸性;有111個R2R3-MYB蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40,為不穩(wěn)定蛋白,2個R2R3-MYB蛋白不穩(wěn)定系數(shù)小于40,為穩(wěn)定蛋白;70個R2R3-MYB蛋白疏水值小于-0.5,為疏水蛋白,其余43個大于-0.5,為親水蛋白。所有的R2R3-MYB蛋白都定位在細(xì)胞核中,表明它們在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控作用功能;所有的R2R3-MYB蛋白都沒有跨膜結(jié)構(gòu)。

表1 假儉草R2R3-MYB蛋白特征

2.3 假儉草R2R3-MYB蛋白的高級結(jié)構(gòu)分析

對假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析(表2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)EoMYBs蛋白二級結(jié)構(gòu)均含有ɑ-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲,大部分無規(guī)則卷曲所占比例最高,介于29.51%(EoMYB58)～69.89%(EoMYB67)之間,說明無規(guī)則卷曲是這些EoMYBs蛋白結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分,其次是ɑ-螺旋,介于17.53%(EoMYB41)～55.89%(EoMYB100)之間,延伸鏈結(jié)構(gòu)(2.80%～15.84%)和β-轉(zhuǎn)角(2.44%～16.20%)相對較低;其中17個EoMYBs蛋白結(jié)構(gòu)的ɑ-螺旋所占比例最高,其次是無規(guī)則卷曲、延伸鏈結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角。綜合分析來看,各R2R3-MYB蛋白的ɑ-螺旋和無規(guī)則卷曲在二級結(jié)構(gòu)中占比相對較高。

MYB蛋白的三級結(jié)構(gòu)與其二級結(jié)構(gòu)有一定聯(lián)系,可以通過三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果來判斷二級結(jié)構(gòu)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過SWISS-MODEL對假儉草R2R3-MYB家族蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖1),R2R3-MYB蛋白都具有ɑ-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲空間結(jié)構(gòu),ɑ-螺旋和無規(guī)則卷曲是EoMYBs蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件,與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測吻合,且都含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)。

2.4 假儉草R2R3-MYB基因的染色體定位

根據(jù)假儉草基因組GFF文件定位113個R2R3-MYB基因,結(jié)果如圖2所示,113個R2R3-MYB基因在9條染色體中均有分布,在各個染色體上分布的數(shù)量不等,在4號染色體上最少,分布8個基因,占整個R2R3-MYB家族的7.08%;在5號染色體上最多,分布19個基因,占整個R2R3-MYB家族的16.81%。此外,發(fā)現(xiàn)在chr4以外的8條染色體上部分基因分布密集,推斷這可能與R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的串聯(lián)復(fù)制有關(guān)。

圖2 假儉草R2R3-MYB基因的染色體定位

2.5 假儉草R2R3-MYB基因家族進(jìn)化樹分析

R2R3-MYB是植物MYB家族中最大的轉(zhuǎn)錄因子之一,對R2R3-MYB基因的研究最多。構(gòu)建假儉草R2R3-MYB和擬南芥R2R3-MYB基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹,如圖3所示。根據(jù)擬南芥R2R3-MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的分組方法[3],將假儉草R2R3-MYB基因劃分為34個亞組,用E1-E34表示。假儉草中有28個亞家族與目前已分類的擬南芥亞家族一致;另有E3和E21亞組是假儉草特有的MYB類型,而E13(S6),E16(S15),E32(S10)和E34(S12)這四個亞組中沒有EoMYBs。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,屬于同一亞家族的R2R3-MYB成員可能具有相同的保守功能。本研究中,假儉草E27亞組(EoMYB11,EoMYB58)與擬南芥S7亞組(AtMYB11,AtMYB12,AtMYB111)成員聚為一類,有研究表明S7亞組成員能夠特異性地調(diào)控黃酮醇生物合成[35],表明假儉草E27亞組成員也可能參與黃酮醇的生物合成。假儉草E5亞組(EoMYB15,EoMYB40,EoMYB73,EoMYB89)和擬南芥S22亞組(AtMYB44,AtMYB70,AtMYB73,AtMYB77)聚為一類,S22亞組成員參與調(diào)控擬南芥的生長和發(fā)育過程[36],表明假儉草E5亞組成員可能也具有相同功能。目前,MYB在假儉草中發(fā)揮的功能尚不清楚,是否具有與擬南芥相應(yīng)的功能和作用,還有待深入研究。

圖3 假儉草與擬南芥R2R3-MYB家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.6 假儉草R2R3-MYB基因家族蛋白保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

通過在線網(wǎng)站MEME預(yù)測113個R2R3-MYB家族成員蛋白保守基序,結(jié)果如圖4A所示。定義了10個特異性基序,命名為基序1～10。大多數(shù)motif基序分布在蛋白序列N端,部分分布在序列中間,更有少數(shù)分布于序列C端。其中,motif3,motif2是假儉草R2R3-MYB家族中最保守的基序,所有成員均含有該保守基序,其次保守的基序motif1,除EoMYB41外,其他112個成員均含有該基序,表明motif1,motif2和motif3是R2R3-MYB蛋白序列的重要組成部分。在該家族進(jìn)化中,motif1,motif2和motif3的結(jié)構(gòu)最為原始,可能具有最保守的功能,推測在此基礎(chǔ)上逐步進(jìn)化出其他基序,形成了功能上的多樣化。

圖4 基于假儉草R2R3-MYB基因結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育分析圖

假儉草R2R3-MYB基因家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析(圖4C),各成員之間的非編碼區(qū)UTR,CDS以及內(nèi)含子存在差異。其中僅28個成員含有UTR區(qū),EoMYB20僅含有3’端UTR;內(nèi)含子數(shù)量在0～13之間,其中有11個成員沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu),大多數(shù)成員具有3個內(nèi)含子,EoMYB13含有11個內(nèi)含子,EoMYB23含有13個內(nèi)含子。

2.7 假儉草R2R3-MYB基因家族順式作用元件分析

啟動子是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件,為了分析假儉草R2R3-MYB基因家族成員啟動子區(qū)上游2 000 bp的序列,利用plantcare在線軟件進(jìn)行分析,預(yù)測的順式作用元件如圖4B所示,可看出假儉草R2R3-MYB基因家族的表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,啟動子類型主要包括光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)元件(脫落酸、茉莉酸甲酯、生長素、赤霉素、水楊酸)、脅迫響應(yīng)元件(干旱、低溫、防御與應(yīng)激、創(chuàng)傷)、器官特異性表達(dá)(種子、胚乳、腭狀中葉、根)以及分生組織表達(dá)、厭氧誘導(dǎo)、晝夜節(jié)律、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、黃酮類生物合成基因的調(diào)控元件。

其中,所有基因家族成員的啟動子都存在光響應(yīng)元件,101個家族成員具有脫落酸響應(yīng)元件,100個家族成員具有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件,75個家族成員具有生長素響應(yīng)元件,66個家族成員具有赤霉素響應(yīng)元件,32個家族成員具有水楊酸響應(yīng)元件;63個家族成員具有干旱響應(yīng)元件,51個家族成員具有低溫響應(yīng)元件,32個家族成員具有防御與應(yīng)激響應(yīng)元件;88個家族成員具有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件。在這些基因家族成員中,最少的含有5個類型順式作用元件,包括EoMYB26,EoMYB43,EoMYB58,EoMYB98;最多的含有14個類型順式作用元件,包括EoMYB25,EoMYB30,EoMYB59,EoMYB60,EoMYB70,EoMYB71,多數(shù)家族成員含有8～12個類型的順式作用元件。這些結(jié)果表明,假儉草R2R3-MYB基因家族成員調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,在光響應(yīng)、植物激素調(diào)控、逆境脅迫響應(yīng)以及氧化損傷響應(yīng),尤其在光響應(yīng)過程中起重要作用。

2.8 假儉草R2R3-MYB基因在干旱脅迫下的表達(dá)水平分析

利用假儉草野生型和抗旱突變體的葉片和根系在干旱前期、中期和后期3個時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),提取113個R2R3-MYB基因?qū)?yīng)的FPKM值,繪制熱圖(圖5)。結(jié)果表明,隨著干旱程度的增加,假儉草R2R3-MYB基因的表達(dá)模式出現(xiàn)差異化。在對葉片進(jìn)行干旱脅迫后得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,有9個基因在野生型和抗旱突變體中均未表達(dá);與假儉草野生型相比,有39個基因在抗旱突變體的一個或多個干旱時期中的表達(dá)量提高,30個基因主要在干旱中期表達(dá),10個基因主要在干旱前期表達(dá),10個基因主要在干旱后期表達(dá),2個基因在干旱前、中期表達(dá),4個基因在干旱前、后期表達(dá),2個基因在干旱中、后期表達(dá),1個基因(EoMYB107)在干旱前、中、后期均進(jìn)行表達(dá)。其中在干旱中期表達(dá)的基因,其基因表達(dá)量都較高。

圖5 EoMYBs基因在葉片(左圖)和根系(右圖)干旱前期、干旱中期、干旱后期表達(dá)模式熱圖

在對根系進(jìn)行干旱脅迫后得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,有3個基因在野生型和抗旱突變體中均未表達(dá);與假儉草野生型相比,有58個基因在抗旱突變體的一個或多個干旱時期中的表達(dá)量提高,36個基因主要在干旱后期表達(dá),34個基因主要在干旱中期表達(dá),16個基因主要在干旱前期表達(dá),其中8個基因在干旱前、中期表達(dá),12個基因在干旱中、后期表達(dá),4個基因在干旱前、中、后期均表達(dá)。與假儉草野生型相比,在對抗旱突變體的葉片和根系處理中,有2個基因(EoMYB3,EoMYB27)在干旱前期表達(dá)量都增高,7個基因(EoMYB3,EoMYB9,EoMYB26,EoMYB43,EoMYB58,EoMYB94,EoMYB-109)在干旱中期表達(dá)量都增高,3個基因(EoMYB26,EoMYB37,EoMYB38)在干旱后期表達(dá)量都增高。推測這些R2R3-MYB基因在假儉草抗旱突變體響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)首次對假儉草R2R3-MYB基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析,共鑒定出113個R2R3-MYB家族成員,在9條染色體上均有分布,且大多分布在染色體兩端,在番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)中也有類似的分布[13,37]。基因復(fù)制在生物進(jìn)化中很常見,本研究中發(fā)現(xiàn)在chr4以外的其他染色體上分布著關(guān)系緊密的基因簇,推測可能是通過基因串聯(lián)復(fù)制事件擴(kuò)大假儉草R2R3-MYB基因家族成員的數(shù)量從而使其功能更豐富,這種擴(kuò)張可能與紫花苜蓿(Medicagosativa)[38]一樣。假儉草R2R3-MYB基因家族成員氨基酸大小、分子量、等電點等差異較大,均定位于細(xì)胞核且無跨膜結(jié)構(gòu)。

本研究參照擬南芥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的分組方式,將假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子歸入34個亞家族,其中28個亞家族成員可歸類到已知的擬南芥亞家族中,假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子未分布于S6,S10,S12和S15四個亞組。其中一些假儉草R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥在同一分枝中,說明這兩個物種基因家族成員可能具有部分相同的功能,如居利香等[13]研究發(fā)現(xiàn)CaMYB10,CaMYB46與擬南芥S1亞組中的AtMYB30,AtMYB96聚為一類,認(rèn)為CaMYB10,CaMYB46與AtMYB30,AtMYB96功能相似,都可通過參與應(yīng)激響應(yīng)而影響辣椒素的合成。本研究中,假儉草的E1亞組(EoMYB6,EoMYB62,EoMYB81,EoMYB97,EoMYB-98,EoMYB99和EoMYB202)與擬南芥S21亞組成員聚為一類,已有研究表明擬南芥該亞組成員與次生細(xì)胞壁生物合成、木質(zhì)素生物合成有關(guān)[39],其中AtMYB52還與耐鹽抗旱相關(guān)[40],推測假儉草E1亞組成員也可能發(fā)揮相同的功能,在植物次生生長過程、非生物脅迫中發(fā)揮作用。此外,擬南芥中亞組S1,S2,S18,S20和S22成員響應(yīng)非生物脅迫[3],推測這些與擬南芥相同分組的假儉草R2R3-MYB家族成員(亞組E23,E26,E8,E9和E5)也可能與非生物脅迫相關(guān)。但是,有4個亞組中僅包含擬南芥成員,推測假儉草中沒有MYB基因能行使這些功能,這與Aoyagid等[41]的研究結(jié)果相似。然而,MYB基因在假儉草中發(fā)揮的功能尚不清楚,是否具有與擬南芥相應(yīng)的功能和作用,還有待深入研究。

對R2R3-MYB基因家族蛋白保守基序、基因結(jié)構(gòu)以及順式作用元件分析可知,該家族成員幾乎都含有motif3,motif4或motif9,motif2和motif1,且多含有3個內(nèi)含子;在所有的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子中,MYB結(jié)構(gòu)域均分布在基因的N端,這些都說明R2R3-MYB蛋白并非隨機(jī)分布,是相對保守的。通過對順式作用元件分析可知,R2R3-MYB蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,主要與光響應(yīng)、植物激素響應(yīng)、脅迫響應(yīng)等相關(guān),說明假儉草R2R3-MYB基因廣泛參與了植物的生命過程。

基因表達(dá)模式與基因功能關(guān)系密切,通過研究假儉草根系和葉片受不同干旱脅迫時期中R2R3-MYB基因表達(dá)情況的變化,發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫各階段發(fā)揮作用的功能基因。已有研究證明R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛響應(yīng)植物非生物脅迫,比如,AtMYB41受干旱誘導(dǎo),在干旱脅迫期間通過調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)張和角質(zhì)層沉積以響應(yīng)非生物脅迫[42];由干旱脅迫誘導(dǎo)的AtMYB96和AtMYB2通過激活脫水反應(yīng)基因(如RD22)正調(diào)節(jié)植物的耐旱性[17,22]。基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),本研究發(fā)現(xiàn)部分R2R3-MYB基因在假儉草野生型和突變體的根系和葉片受干旱脅迫的不同時期特異性表達(dá)。例如與假儉草野生型相比,在對突變體的葉片和根系處理中,EoMYB3和EoMYB27在干旱前期表達(dá)量高,EoMYB3,EoMYB9,EoMYB26,EoMYB43,EoMYB58,EoMYB94和EoMYB109在干旱中期表達(dá)量高,EoMYB26,EoMYB37,EoMYB38在干旱后期表達(dá)量高,推測這些基因是差異表達(dá)基因,并特定時期下高表達(dá)豐度的基因可能參與假儉草突變體干旱脅迫響應(yīng)過程。

4 結(jié)論

本研究在假儉草中共鑒定到113個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因,并通過生物信息學(xué)分析了其理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件。同時,通過分析假儉草在不同干旱處理下的根系和葉片表達(dá)特性,發(fā)現(xiàn)與假儉草野生型相比,抗旱突變體葉片中有39個基因在一個或多個干旱時期中的表達(dá)量提高,抗旱突變體根系中有58個基因在一個或多個干旱時期中的表達(dá)量提高,推測這些R2R3-MYB基因在響應(yīng)干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究假儉草R2R3-MYB基因家族成員的功能提供了理論依據(jù)和參考。