Wnt細胞信號轉導通路在糖尿病足形成過程中的調節機制

楊陸濤 張友來 陳秋瑩 曹青

(1九江市第一人民醫院燒傷外科,江西 九江 332000;2南昌大學第一附屬醫院燒傷及創面修復中心)

糖尿病足是糖尿病患者由于下肢遠端神經異常和血管病變導致的,患者的臨床癥狀為足部感染、潰瘍、足趾畸形等,若不及時治療,可能導致糖尿病患者截肢和死亡〔1〕。糖尿病足目前臨床上尚未有準確的發病機制,有研究認為其與修復細胞、炎性細胞及細胞因子等參與的多重反應有關〔2〕。Wnt細胞信號轉導通路能夠有效促進上皮重塑及創面血管新生,與糖尿病足的形成關系密切〔3〕。Wnt/β-連環蛋白(catenin)是Wnt細胞通路中典型通路,Wnt/β-catenin細胞信號轉導通路與糖尿病大鼠難愈創面有關〔4〕。本研究旨在探討Wnt細胞信號轉導蛋白在不同Wagner分級糖尿病足患者形成過程中的調節機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 于2021年5月至2022年6月構建糖尿病足大鼠動物實驗模型,選取100只6周齡SD雌鼠為試驗對象,將大鼠隨機分為糖尿病足組及對照組各50只。大鼠群按照分組養于兩只相同飼料籠。對照組體質量158～179 g,平均(164.34±5.19)g;糖尿病足組體質量159～179 g,平均(164.39±5.22)g。兩組體質量無顯著差異(P>0.05),組間可比。

1.2方法 兩組均予以適應性飼養1 w:保持溫度21～23 ℃,相對濕度50%～55%,自由飲水、進食,光照黑暗各12 h。1 w后,對照組給予普通飼料繼續飼養,糖尿病足組給予高脂高糖飼料。第3周起,測量兩組隨機血糖后,糖尿病足組一次性腹腔注射1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液(30 mg/kg,以0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制),對照組腹腔注射同體積0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ溶液后第3、7、14天時,測量兩組隨機血糖。當糖尿病足組隨機血糖≥16.7 mmol/L則糖尿病模型建立成功。建立糖尿病模型成功后1 w,對兩組靜脈注射3%戊巴比妥鈉行麻醉,采用薄鐵片連續按壓大鼠足部,并用冰醋酸連續涂抹,制作糖尿病足模型,待大鼠下肢出現紅腫潰瘍等異樣變化,記錄創面面積。

1.3觀察指標 ① 造模過程中血糖水平變化:注射STZ溶液后第3、7、14天,檢測隨機血糖。② 觀察兩組創面造模第3、7、14天的創面愈合情況,計算創面愈合面積,愈合率=愈合面積/創口面積。③ 創面組織中β-catenin、糖原合成酶激酶(GSK)-3β表達情況:分別于創面造模后第3、7、14天,使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠,麻醉成功后,采集創面及創周2 mm的組織,將組織剪碎后置于機械組織勻漿器內,組織與裂解液按 1∶10 比例加入,冰浴30 min,4 ℃下離心半徑6 cm,13 000 r/min 離心10 min,取蛋白提取液,采用酶聯免疫吸附試驗檢測β-catenin、GSK-3β蛋白表達情況。④創面組織中β-catenin、GSK-3β mRNA表達情況。創面組織采集同③,采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測β-catenin、GSK-3β mRNA表達情況。

1.4統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1造模過程中血糖水平變化 注射STZ溶液前兩組血糖水平差異不顯著(P>0.05);注射后第3、7、14天,糖尿病足組血糖均顯著高于對照組(P<0.05),見表1。

表1 兩組造模過程中血糖水平及創面愈合情況

2.2創面愈合情況 創面造模第3、7、14天,對照組創面愈合率均顯著高于糖尿病足組(P<0.05),見表1。

2.3β-catenin、GSK-3β蛋白和mRNA表達 創面造模后第3、7、14天,糖尿病足組β-catenin蛋白和mRNA含量均顯著低于對照組,GSK-3β蛋白和mRNA均顯著高于對照組(P<0.05),見表2、表3。

表2 兩組創面造模后不同時間點β-catenin、GSK-3β蛋白表達

表3 兩組創面創模后不同時間點β-catenin、GSK-3β mRNA表達

3 討 論

多數糖尿病患者自感覺性神經受損,自感覺性神經病變可導致患者皮膚溫度調節功能、血液循環能力及排汗調節功能等異常,造成局部組織柔韌性降低,再加上炎癥因子、細胞因子的反復作用,導致皮膚開裂、破碎等。運動神經病變引起足內肌攣縮,導致姿勢和協調缺陷,且會增加跖骨頭壓力,引起足部潰瘍等,且血管病變又使破壞的組織難以愈合,繼而導致糖尿病足的發生,并加重病情〔5～6〕。

糖尿病足是一種慢性疾病,且糖尿病足創面潰瘍的愈合是一個長期、緩慢的過程,這個過程中成纖維細胞及表皮干細胞的激活、分化起重要作用,Wnt/β-catenin細胞信號轉導通路是調控成纖維細胞及表皮干細胞分化的關鍵信號〔7～9〕。Wnt/β-catenin細胞信號轉導通路能夠促進創面血管新生、上皮重塑,誘導皮膚附件形成,促進創面愈合〔10～11〕。β-catenin是一種多功能蛋白,廣泛分布于成纖維細胞、成骨細胞中,進入細胞核中可參與并影響基因的表達,調控這些細胞的增殖、分化及凋亡過程,β-catenin在Wnt信號途徑中起細胞內信號轉導的作用,且β-catenin穩定性增強僅僅依賴于Wnt信號途徑〔12～14〕。GSK-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,可調控糖原合成,參與調控細胞分化、凋亡、干細胞維持及腫瘤的發生等,GSK-3β能夠負性調節Wnt細胞信號轉導通路〔15～17〕。正常情況下,Wnt細胞信號通路關閉,細胞質中β-catenin水平極低,但當機體受到刺激,Wnt細胞信號轉導通路被激活,Wnt與相關蛋白結合,信號傳導,抑制β-catenin及GSK-3β被水解,造成β-catenin及GSK-3β在細胞質中積累,β-catenin進入細胞核,調節細胞的生長、分化〔18,19〕。有動物實驗指出,糖尿病大鼠模型的潰瘍創面中Wnt/β-catenin信號通路功能低下,β-catenin細胞陽性率低〔20〕。本研究提示,Wnt/β-catenin信號通路可能促進創面愈合〔21〕。