他喹莫德對人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性表型的影響及相關(guān)機(jī)制

柳曉蕊 袁忠民 郅程 張媚媚 簡曉順 彭懷東

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部（廣州 510095）；廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2神經(jīng)科學(xué)研究所，3病理科，4藥學(xué)部（廣州 510260）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，GBM 細(xì)胞有高度增殖、浸潤性生長的生物學(xué)特性，手術(shù)難以全部切除，患者預(yù)后極差［1］。同時，由于血腦屏障的存在，大部分分子量大、脂溶性差的化療藥物難以到達(dá)病灶發(fā)揮藥效，目前除替莫唑胺外臨床上可用于治療GBM 的藥物極少［2］。而GBM 作為高級別膠質(zhì)瘤，對替莫唑胺的耐藥率也高達(dá)50%～75%［3］，因此臨床迫切需要開發(fā)一些新的藥物用于治療GBM。近年來研究表明在GBM 內(nèi)存在驅(qū)動腫瘤發(fā)生的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cell，GSC）亞群，盡管該細(xì)胞亞群在GBM 中占比非常低，但是這些GSC 具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能，被認(rèn)為是導(dǎo)致GBM 進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐受放化療的重要原因［4］。因此靶向抑制GSC 是治療惡性GBM的重要策略，探索尋找對GBM 干細(xì)胞特性有抑制作用的藥物也是抗GBM 藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

他喹莫德（Tasquinimod，Tasq）是由法國益普生（Ipsen）公司和瑞典活躍生物（Active Biotech）公司共同開發(fā)的用于治療前列腺癌的小分子藥物［5］。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗結(jié)果顯示Tasq 對前列腺癌具有很好的療效和安全性［6］，目前尚未上市。已有的研究表明Tasq 是組蛋白去乙酰化酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）特異性的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑［7］，同時也是鈣結(jié)合蛋白S100A9 蛋白的抑制劑［8］。Tasq能夠作用于腫瘤微環(huán)境，具有克服腫瘤相關(guān)免疫抑制，抑制腫瘤生長、血管生成、轉(zhuǎn)移的潛力［9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HDAC4 在人源GBM 組織中高表達(dá)并與腫瘤惡性程度相關(guān)，HDAC4 通過調(diào)控MKK7/JNK/c-Jun 信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)GBM 細(xì)胞增殖、侵襲［10］。作為一種新型藥物，推測Tasq 在治療GBM方面具有巨大的潛力。為此，本研究通過體外培養(yǎng)U87、U251 和人源GSC 等探討Tasq 對GBM細(xì)胞系增殖、遷移、EMT、干細(xì)胞特性等惡性表型的影響，為該藥進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于臨床治療GBM提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞GBM 細(xì)胞株U87、U251 購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；GSC 細(xì)胞株為蘇州大學(xué)歐陽佳博士惠贈。

1.2 主要藥品與試劑Tasq（純度＞ 99%）購自Selleck 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、Neurobasal 培養(yǎng)基、B27 添加劑、EGF、bFGF、青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Gibco 公司；DMSO、CCK-8試劑盒、多聚甲醛購自美國Sigma 公司；一步法TUNNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、免疫染色通透液（Triton X-100）、BCA蛋白檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Transwell板購自美國CORNING公司；4'，6-二脒基-2苯基吲哚（DAPI）購自Thermofisher公司；單克隆抗體Snail 購自Abcam 公司，Cleaved Caspase-3、BCL-2、Vimentin、SOX2、Nestin、Actin 等單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司。

1.3 藥物溶解25 mg Tasq 加入1.23 mL DMSO 制成50 mmol/L 的儲備液。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)將U87 和U251 置于含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；GSC置于含有20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、1%谷氨酰胺和2% B27 的Neurobasal 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境均為5% CO2、37 ℃。

1.5 細(xì)胞活力測定取對數(shù)期生長的U87 和U251制成單細(xì)胞懸液，并以每孔4×103接種至96 孔板，培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁后，分別加入含有Tasq 0、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L 的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 或48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育1 h 后用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm 處的吸光度并計算細(xì)胞存活率，每個濃度設(shè)置5 個副孔并重復(fù)3 次。

1.6 細(xì)胞凋亡染色將U87 和U251 以每孔2×104個接種于24 孔板中，貼壁后分別加入含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS 洗滌1 次后用4%多聚甲醛固定30 min，接著用PBS 洗滌1 次，然后用PBS 稀釋的0.3% Triton X-100 室溫下孵育5 min，接著洗滌2 次，加入100 μL TUNEL 檢測液在37 ℃下孵育60 min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，使用計算機(jī)成像系統(tǒng)從顯微鏡下隨機(jī)選取5 個視野拍照（×200），計數(shù)并統(tǒng)計凋亡細(xì)胞占比，重復(fù)3 次。

1.7 細(xì)胞克隆實(shí)驗將U87 和U251 以每孔500 個接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，貼壁后分別加入含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 清洗2 次后用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，然后拍照計數(shù)，重復(fù)3 次。

1.8 細(xì)胞Transwell 遷移實(shí)驗將U87 和U251 以每孔1×105個接種于六孔板中，貼壁后分別加入含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，收集每組細(xì)胞并計數(shù)。使用孔徑為8 μm、24 孔的Transwell板，在Transwell 上室中，加入200 μL 含1% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，其中細(xì)胞密度為2×104個每孔，下室加入600 μL 含有20% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，24 h 后用乙醇固定30 min 后再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽小心擦去微孔膜上層細(xì)胞，PBS 清洗2 次，隨機(jī)選擇5 個視野拍照（×100），計數(shù)并重復(fù)3 次。

1.9 細(xì)胞成球?qū)嶒瀸SC以每板3 000個接種于6 cm 超低附著培養(yǎng)板后，加入含有相應(yīng)濃度藥物的Neurobasal 培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d 后顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個不同視野拍照（×100），對直徑大于50 μm的微球進(jìn)行計數(shù)，重復(fù)3 次。

1.10 免疫熒光染色將細(xì)胞成球?qū)嶒灥母鹘M細(xì)胞分別接種于多聚賴氨酸包被的細(xì)胞爬片上。1 h后，用PBS沖洗3次，在室溫下用含有0.3% Triton X-100 的山羊血清固定1 h。然后每個玻片滴加300 μL PBS 稀釋的5% BSA 封閉30 min，滴加兔抗Sox2 一抗（1∶1 000）、兔抗Nestin 一抗（1∶1 000）稀釋液在4 ℃下?lián)u床孵育過夜。PBS 沖洗玻片后用熒光標(biāo)記的二抗在室溫下孵育2 h。樣品漂洗1 次，用DAPI 染色10 min，再次洗滌以去除多余的DAPI 并風(fēng)干。在共聚焦顯微鏡下對載玻片成像并計算平均熒光強(qiáng)度，重復(fù)3 次。

1.11 Western blot 實(shí)驗U87 和U251 細(xì)胞以每孔1×105個接種于六孔板中，貼壁后加入含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，然后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 沖洗2 次后收集各組細(xì)胞。收集經(jīng)含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d 的GSC。對各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液處理，超聲和離心后使用BCA 試劑盒對樣品進(jìn)行蛋白濃度檢測。使用10%的SDS-PAGE 凝膠電泳離蛋白樣品2 h，然后用 PVDF 膜電轉(zhuǎn)1.5 h，并在5%脫脂牛奶中封閉60 min。將封閉后的PVDF 膜放在相應(yīng)的一抗（1∶1 000）中孵育過夜，水平搖床低速震蕩1 h 后用TBST 洗滌3 次，再放入相應(yīng)的二抗（1∶5 000）中搖床低速震蕩1 h。二抗孵育完成后用TBST 洗滌3 次，使用ECL 檢測系統(tǒng)曝光條帶，實(shí)驗重復(fù)3 次。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。重復(fù)實(shí)驗的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜ 0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tasq 對U87、U251 細(xì)胞增殖的影響CCK-8法結(jié)果見圖1，Tasq 作用于U87 和U251 細(xì)胞24 h后，相較于對照組（0.1% DMSO），10 μmol/L 的Tasq 即可以顯著降低U87 和U251 的細(xì)胞存活率（P＜ 0.01），且濃度越高細(xì)胞存活率越低；48 h 的細(xì)胞存活率顯著低于24 h（P＜ 0.01）。Tasq 對U87和U251 細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性及時間依賴性。Tasq 作用于U87 和U251 細(xì)胞48 h 的IC50分別為39.76、42.32 μmol/L。因此，參考相應(yīng)的IC50值本研究選取Tasq 的濃度為0、20、40 μmol/L，作用時間為48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

圖1 Tasq 抑制U87 和U251 細(xì)胞的增殖Fig.1 Tasq inhibited proliferation of U87 and U251 cells

2.2 Tasq 對U87、U251 細(xì)胞凋亡的影響TUNEL細(xì)胞凋亡染色結(jié)果顯示，Tasq 可誘導(dǎo)U87 和U251細(xì)胞發(fā)生凋亡（圖2A-B），且濃度越大，凋亡細(xì)胞占比越大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖2C。Western blot檢測凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和抗凋亡蛋白BCL-2的表達(dá)，結(jié)果顯示，Tasq可促進(jìn)Cleaved Caspase-3表達(dá)，下調(diào)BCL-2的表達(dá)（圖2D）。

2.3 Tasq 對U87、U251 細(xì)胞遷移的影響Transwell 遷移實(shí)驗結(jié)果顯示，與對照組比，隨著Tasq 濃度的增加，U87和U251遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖3。結(jié)果表明，Tasq抑制U87和U251細(xì)胞的遷移能力。

2.4 Tasq 對U87、U251 集落形成的影響克隆形成實(shí)驗結(jié)果顯示，與對照組比，且隨著Tasq 濃度的增加，U87 和U251 細(xì)胞形成的集落數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖4。結(jié)果表明，Tasq抑制U87和U251細(xì)胞集落形成的能力。

2.5 Tasq對U87、U251細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot 檢測結(jié)果表明，0、20、40 μmol/L的Tasq處理U87和U251后，隨著Tasq濃度的增加，EMT 相關(guān)蛋白Snail、Vimentin 的蛋白表達(dá)量依次下降，見圖5。實(shí)驗結(jié)果提示Tasq 能抑制U87 和U251 細(xì)胞的EMT。

2.6 Tasq 對GSC 成球能力的影響鑒于GSC 在GBM 進(jìn)展和復(fù)發(fā)中的關(guān)鍵作用，通過球體形成實(shí)驗評價Tasq 對GSC 成球能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組比，隨著Tasq 濃度的增加，GSC 在懸浮培養(yǎng)基中形成球體的數(shù)量依次減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖6。結(jié)果表明，Tasq 抑制GSC的成球能力。

2.7 Tasq 對GSC 干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 進(jìn)一步探討Tasq 對GSC 干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，通過免疫熒光染色和Western blot 檢測經(jīng)Tasq 處理5 d 后GSC 中干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白Sox2 和Nestin 表達(dá)的情況。免疫熒光染色實(shí)驗結(jié)果表明，隨著Tasq 濃度的增加，GSC 形成的球體中Sox2、Nestin 的原位表達(dá)減少，相對熒光強(qiáng)度顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），見圖7A-B。Western blot 檢測結(jié)果表明，隨著Tasq 濃度的增加，GSC 中Sox2、Nestin 的蛋白表達(dá)量依次下降，見圖7C。上述實(shí)驗結(jié)果提示Tasq 抑制GSC 的干細(xì)胞特性。

3 討論

在前列腺癌的研究中，Tasq 被認(rèn)為是一種口服抗血管生成的藥物。Tasq 可以顯著上調(diào)前列腺癌組織中凝血栓蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）及其mRNA 的表達(dá)，高表達(dá)的TSP-1 可以抑制成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）的表達(dá)，同時TSP-1 作為缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）的上游基因，通過抑制HIF-1α 負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)［8］。FGF 和VEGF 是促進(jìn)前列腺癌血管生成的關(guān)鍵因子［11］，Tasq 通過調(diào)控TSP-1 進(jìn)而負(fù)調(diào)控VEGF 和FGF 的組織水平，阻斷其在內(nèi)皮細(xì)胞上的受體，將“血管生成開關(guān)”轉(zhuǎn)化為抗血管生成狀態(tài)，從而抑制新生血管形成和轉(zhuǎn)移［11-12］。Tasq 還被認(rèn)為通過特異性的與HDAC4 蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合，通過改變HADC4的整體構(gòu)像調(diào)控HDAC4活性［7］，而HDAC-4/NCOR/HDAC-3 復(fù)合體是HIF-1α 去乙酰化所必需的，所以Tasq 通過調(diào)控HDAC4 阻止HIF-1α 的去乙酰化抑制VEGF 的轉(zhuǎn)錄［13］。總之，Tasq 通過作用于TSP-1 和HDAC4 兩個關(guān)鍵的靶點(diǎn)，抑制HIF-1α及其下游基因進(jìn)而抑制低氧誘導(dǎo)的血管生成。

圖3 Tasq 抑制U87 和U251 細(xì)胞的遷移Fig.3 Tasq inhibited migration of U87 and U251 cells

Tasq 還可以作用于腫瘤微環(huán)境，其機(jī)制為Tasq 抑制腫瘤環(huán)境中髓源性抑制細(xì)胞（myeloidderived suppressor cell，MDSC）和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage，TAM）的浸潤，并促進(jìn)TAM 中抑制免疫反應(yīng)并促進(jìn)血管生成的M2表型向促進(jìn)免疫反應(yīng)并抑制血管生成的M1 表型轉(zhuǎn)化［9，14］。在MDSC 中，在鋅存在的條件下鈣結(jié)合蛋白S100A9 與toll 樣受體-4、晚期糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；S100A9 還可以將炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞招募到轉(zhuǎn)移位點(diǎn)。髓樣細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表達(dá)的S100A9 促進(jìn)MDSC 和TAM 的積累和激活［15］。而Tasq 是S100A9 抑制劑［16］，通過抑制S100A9 蛋白活性發(fā)揮抗炎和調(diào)節(jié)MDSC 的作用。基于Tasq 獨(dú)特的抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)的組合作用，該藥單藥或聯(lián)合其他藥物有望用于治療臨床各種實(shí)體腫瘤。

腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡之間嚴(yán)重失衡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡是治療腫瘤的重要策略。本研究發(fā)現(xiàn)Tasq 能夠呈濃度依賴性和時間依賴性地抑制U87 和U251 增殖，抑制抗凋亡基因BCL-2 的表達(dá)并激活Cleaved Caspase-3 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)Tasq 通過調(diào)控HDAC4 活性進(jìn)而調(diào)控HDAC4/KLF5/SP1 復(fù)合物介導(dǎo)MKK7/JNK/c-Jun 信號傳導(dǎo)通路抑制GBM 細(xì)胞增殖，Tasq 通過JNK 信號通路參與調(diào)控GBM 細(xì)胞增殖、凋亡［10］。HDAC4 還可以通過增強(qiáng)CDK1 和CDK2 的表達(dá)，抑制p21 和p27 的表達(dá)來改善膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和周期進(jìn)程［17］。鑒于HDAC4 在調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的重要作用和Tasq 特異性地與HDAC4 結(jié)合并抑制其乙酰化作用，推測Tasq 可能通過調(diào)控HDAC4 活性抑制U87 和U251 增殖并促進(jìn)其凋亡，但是詳細(xì)的機(jī)制尚不完全明確。

圖4 Tasq 抑制U87 和U251 細(xì)胞的集落形成Fig.4 Tasq inhibited the colony forming ability of U87 and U251 cells

圖5 Tasq 抑制U87 和U251 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白（Snail、Vimentin）的表達(dá)Fig.5 Tasq inhibited the expression of EMT-related proteins（Snail、Vimentin）in U87 and U251 cells

GBM 呈浸潤性生長的特性主要是因為腫瘤細(xì)胞獲得了向周邊腦組織高遷移和侵襲的能力所致，而EMT 是GBM 細(xì)胞獲得這一特性的關(guān)鍵機(jī)制［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)Tasq 能夠抑制U87 和U251 的遷移，并抑制EMT 相關(guān)基因Snail 和Vimentin 的表達(dá)。Tasq 對Snail 和Vimentin 表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不明確。有研究表明，HDAC4 能夠激活氣道上皮細(xì)胞的EMT，下調(diào)HDAC4 表達(dá)可減少氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT［20］；過表達(dá)HDAC4 增強(qiáng)了U251 細(xì)胞中Vimentin、β-catenin 和E-cadherin 等EMT 標(biāo)記物的表達(dá)［17］。在鼻咽癌細(xì)胞中Tasq 通過抑制HDAC4抑制其EMT［21］。因此，Tasq 可能通過調(diào)控HDAC4抑制U87 和U251 細(xì)胞遷移及EMT，但是具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖6 Tasq 抑制GSC 的球體形成Fig.6 Tasq inhibited sphere formation of GSC

圖7 Tasq 抑制GSC 干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白（Sox2、Nestin）的表達(dá)Fig.7 Tasq inhibited the expression of stem cell-related proteins（Sox2、Nestin）in GSC

盡管GBM 具有高度異質(zhì)性［22］，在GBM 中存在一群類似干細(xì)胞樣的腫瘤干細(xì)胞，被稱為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞，GSC 與腫瘤發(fā)生、持續(xù)生長和復(fù)發(fā)密切關(guān)聯(lián)［23］。鑒于GSC 在GBM 進(jìn)展中的重要作用，本研究探討了Tasq 對GSC 干細(xì)胞特性的影響，本研究發(fā)現(xiàn)Tasq 能夠顯著抑制GSC 球體形成能力、抑制干細(xì)胞相關(guān)基因SOX2 和Nestin 的表達(dá)。從單一腫瘤細(xì)胞形成完整克隆是腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞特征的重要表現(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)Tasq 能夠顯著抑制U87 和U251 集落形成。上述結(jié)果表明Tasq可以在體外抑制GBM 細(xì)胞系的干細(xì)胞特性特征。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Tasq 可在體外抑制GBM 細(xì)胞增殖、遷移、集落形成和EMT，并促進(jìn)其凋亡；Tasq 抑制GSC 成球能力和干細(xì)胞特性相關(guān)蛋白的表達(dá)。基于課題組前期的研究結(jié)果和在前列腺癌中已被證實(shí)的研究結(jié)果，我們認(rèn)為Tasq產(chǎn)生上述作用的機(jī)制與其特異性地作用于HDAC4、多途徑抑制血管生成的多個關(guān)鍵靶基因和調(diào)控腫瘤微環(huán)境有關(guān)，Tasq 通過抑制GBM 細(xì)胞增殖、遷移、EMT、干細(xì)胞特性等惡性表型抑制其惡性進(jìn)展。下一步，將通過裸鼠皮下成瘤或直接顱內(nèi)成瘤實(shí)驗探討該藥在體內(nèi)對GBM 的效果并探討體內(nèi)作用機(jī)制是否與體外作用機(jī)制一致，以期進(jìn)一步為開發(fā)Tasq作為抗GBM治療藥物提供研究基礎(chǔ)。

【Author contributions】LIU Xiaorui performed the experiments and wrote original draft.YUAN Zhongmin provided resources.ZHI Cheng and ZHANG Meimei collected data and validated.JIAN Xiaoshun conducted supervision.PENG Huaidong designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.