茶葉斑病病原菌Epicoccum mackenziei致病性與生長特性研究

吳 雙,張 駿,江仕龍,2,李冬雪,唐 芹,馬友力,3,王德爐,陳 卓*

(1.貴州大學 綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025;2.貴州大學 農(nóng)學院,貴州 貴陽 550025;3.貴州大學 茶學院,貴州 貴陽 550025; 4.貴州大學 林學院,貴州 貴陽 550025)

茶樹(Camelliasinensis(L.)Kuntz)作為一種非常重要的經(jīng)濟作物,在中國被廣泛種植。2021年貴州省茶園面積達714.6萬畝,種茶面積連續(xù)十年位居中國第一,是中國主要的茶葉產(chǎn)區(qū)[1-3]。由于受低緯度、高海拔、寡日照、多云霧及倒春寒天氣頻發(fā)等因素的影響,貴州省茶樹病害發(fā)生流行較為復雜,對茶葉產(chǎn)量以及品質的影響較大[4]。如陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Colletotrichumcamelliae引起的茶炭疽病[5],Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis引起的茶輪斑病[6],以及Diaporthenobilis[7]、Phomasegeticolavar.camelliae[8]、Lasiodiplodiatheobromae[2,9]、Epicoccumsorghinum[1]、Epicoccumnigrum[10]、Didymellabellidis[11]等病原菌引起的茶葉斑病;Exobasidiumvexans引起的茶餅病[12]以及Elsinoeleucospila引起的茶白星病[13]。因此,貴州茶樹病害的防治對茶葉品質和產(chǎn)量至關重要。目前針對Epicoccummackenziei引起的植物病害研究報道較少,但其隸屬于Epicoccum,Epicoccum大多是腐生,可引起多種植物的病害。本課題組于2020年至2021年,在貴州省思南縣、石阡縣和開陽縣的茶園進行田間調查,調查發(fā)現(xiàn)該區(qū)域發(fā)生茶葉斑病,其中發(fā)現(xiàn)12個茶園中茶葉斑病的發(fā)生率約51%～58%,病害嚴重度約34%～43%。這些茶葉斑病對茶葉產(chǎn)量和品質構成一定的影響。因此,為了探明該病害的病原,并提出有效的防控措施,本文對貴州省上述茶葉產(chǎn)區(qū)的茶葉斑病進行了病原鑒定、致病性分析和生物學特性的初步研究。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

2020年至2021年,團隊在貴州省思南縣(27.74°N,108.35°E)、石阡縣(27.74°N,107.56°E)和開陽縣(27.96°N,107.34°E)的12個茶園采集了19個發(fā)生典型葉斑病病害癥狀的茶葉枝條,并記錄茶樹葉斑病病害發(fā)生特征。

1.2 菌株的分離和純化

將采集到的自然發(fā)病茶樹病葉帶回實驗室,采用改良的組織法[2],從病害樣本中分離病原菌[14]。將葉片從病變組織和健康組織的交界處切成約3 mm×3 mm的小葉塊,然后用75%乙醇表面消毒30 s,接著用0.5%次氯酸鈉浸泡5 min,后用無菌水漂洗3次。將消毒后的組織塊接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA),并在生化培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)中培養(yǎng),在25℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)3～5 d。通過在PDA上進行多輪次培養(yǎng),進一步純化真菌菌株。菌株SN2-3、KY45、SQ2-2和SQ2-15已寄送至中國普通微生物菌種保藏管理中心和中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心進行保存,菌株保藏號分別為CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054。然后將6 mm菌碟轉移至不同種類的培養(yǎng)基中生長并觀察菌株的生長特性。

1.3 形態(tài)學觀察

將菌株CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054接種到PDA上培養(yǎng)活化,并取6 mm菌碟接種至PDA、麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基(Malt Extract Agar,MEA)和燕麥片瓊脂培養(yǎng)基(Oatmeal Agar,OA)。在25 ℃和黑暗條件下,持續(xù)培養(yǎng)。觀察菌株在3種培養(yǎng)基上的菌落生長情況、菌落形態(tài)特征、菌絲豐度及色素分泌等特征。同時,將滅菌的松針置于PDA培養(yǎng)基誘導菌絲產(chǎn)孢,觀察菌株的產(chǎn)孢特征。待產(chǎn)孢后,采用奧林巴斯顯微鏡(Olympus,BX43和FVMPE-RS)觀察致病菌的產(chǎn)孢結構和分生孢子的形態(tài)[11,15-16]。

1.4 致病性測定

根據(jù)文獻方法[14],將分離獲得的菌株接種至茶樹葉片進行致病性測定。以福鼎大白茶(C.sinensiscv.Fuding-dabaicha)為致病性試驗的茶葉品種,茶樹種植于貴州省貴陽市貴州大學(26.26°N,106.40°E)大棚溫室內,溫室白天和晚上保持在25 ℃,周期為14 h光照和10 h黑暗,相對濕度為70%～80%,茶樹樹齡約5年。在實驗室條件下,選擇健康植株的前3葉進行接種研究。接種方式采用損傷方式和無損方式,其中損傷方式采用無菌針頭針刺相鄰的孔。在前3片葉子上分別接種來自真菌培養(yǎng)物的分生孢子懸浮液(106CFU/mL)或菌絲塞(PDA上培養(yǎng)5 d,直徑6 mm),并以無菌PDA或無菌水作為對照。田間致病性試驗地在貴州省花溪區(qū)久安村(27.74°N,108.35°E,海拔575 m)。茶樹品種為福鼎大白茶,茶樹樹齡為30年,茶樹葉齡為40 d。田間致病性試驗前30 d,茶園未采用農(nóng)藥進行防治。田間試驗采用菌碟和分生孢子懸浮液進行接種,接種方式采用損傷和無損的方式。試驗獨立重復3次。每個處理在15株茶樹的15根枝條進行。

1.5 分子鑒定

采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒及按照使用說明提取病原菌菌絲DNA。對內轉錄間隔區(qū)(The internal transcribed spacer,ITS)、部分28S大亞單位rDNA(the partial 28S large subunit rDNA,LSU)、RNA聚合酶II第二大亞基(RNA polymerase II second largest subunit,RPB2)和β-微管蛋白基因(beta-tubulin,TUB)進行擴增,引物分別采用ITS1/ITS4[17]、LR0R/LR5[18-19]、RPB2-5F2/fRPB2-7cR[20-21]和TUB2Fd/TUB4Rd[22]。采用HS Taq酶(Takara,寶生物大連公司)試劑進行PCR檢測。反應程序:94 ℃,預變性2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,35個循環(huán);72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術有限公司進行基因測序,測序結果提交至GenBank。結合ITS序列的BLAST比對結果,選擇參比序列。利用DNAMAN 8.0軟件進行拼接及序列多重比對。采用PAUP v4.0b10(Swofford 2003)及最大簡約法(Maximum Parsimony,MP)進行聚類分析及進化樹構建,基因的系統(tǒng)進化樹分析方法選擇Bootstrap,重復次數(shù)為1000,最大的樹數(shù)目設置為10 000。

1.6 菌株生長特性的測定

采用文獻方法[23-24],研究菌株CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054在PDA、OA和MEA培養(yǎng)基上的生長速率、菌落形態(tài)和菌絲色素。菌株生長于25 ℃和黑暗條件。每個處理設5次重復,試驗獨立重復3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用方差分析(ANOVA),以最小顯著法(Least-significant difference,LSD)分析不同處理組間的差異顯著性,以不同小寫字母表示差異是否顯著。

2 結果與分析

2.1 茶葉斑病的田間癥狀

據(jù)田間調查表明,茶葉斑病多發(fā)于茶樹嫩芽和嫩葉,尤其是葉片邊緣。發(fā)病初期為淡褐色小葉斑,隨著發(fā)病時間延長,病斑逐漸變?yōu)榧t褐色,并擴大至1～2 mm。當病斑數(shù)量增多后,相鄰病斑可融合形成不規(guī)則較大的病斑,葉片枯萎,變形,顏色失澤,葉片柔韌度降低(圖1)。

注:圓圈內為葉斑病的癥狀。

2.2 茶樹葉斑病病原鑒定

2.2.1形態(tài)學特征

EpicoccummackenzieiCGMCC 3.20225菌株接種至MEA培養(yǎng)基上,在25 ℃和黑暗條件下培養(yǎng)10 d,培養(yǎng)基表面產(chǎn)生孢子囊,大小約100～500 μm,呈黑色球狀或液滴狀(圖2-a)。壓碎孢子囊后鏡檢,發(fā)現(xiàn)孢子囊內有分生孢子器,分生孢子器的細胞壁上有產(chǎn)孢細胞,和不同成熟度的分生孢子,顏色深淺不一(圖2-b)。厚垣孢子呈深褐色半透明狀,帶有疣狀突起或瘤狀突起,單生或成鏈狀,范圍在(10.92±2.48)μm×(9.93±2.89)μm(n=50)(圖2-c)。分生孢子為單細胞或多細胞,灰色,球形或梨形,直徑分別為(14.58±1.76)μm(長)和(9.39±1.87)μm(寬)(n=50)(圖2-d)。經(jīng)與文獻比較,發(fā)現(xiàn)菌株的形態(tài)特征與E.mackenziei相似[25]。

注:a.分生孢子器;b.產(chǎn)孢細胞和分生孢子;c.厚垣孢子;d.分生孢子。

2.2.2病原菌的致病性

室內致病性試驗表明,接種菌碟24 h后,第一葉、第二葉和第三葉均有病斑形成(圖3-a)。接種48 h后,病斑逐漸擴大,特別是第一葉,而第二葉和第三葉的病害變化不明顯(圖3b～d)。接種分生孢子懸浮液后,分生孢子萌發(fā)和茶葉病變時間相對較長,分生孢子接種處理的病斑比菌碟接種處理的病斑小(圖3～f)。針對接種無菌PDA或無菌水的對照處理,前3葉均沒有觀察到癥狀(圖3～e)。此外,接種茶樹莖部72 h后,也觀察到病斑(圖3～g)。田間致病性試驗表明,在接種菌碟2 d后,田間的病害癥狀與實驗室病害癥狀相同。同時,以分生孢子懸浮液接種的茶葉病害比菌碟接種的茶葉病害弱(圖3～i)。對照組處理沒有出現(xiàn)病害癥狀(圖3～j)。

注:a～h:室內致病試驗。a～e.菌碟的致病性試驗。a.頂部前三葉;b.第一葉;c.第二葉;d.第三葉;e.對照處理。f.分生孢子懸浮液的致病性試驗;g～h:茶樹莖部致病性試驗(g.菌碟的致病性試驗;h.無菌PDA的對照試驗);i～j:田間致病性試驗(i.菌碟的致病性試驗;j.無菌PDA的對照試驗)。箭頭所指為病斑或接種位置。

2.2.3分子生物學鑒定

向Genbank提交菌株的基因或核酸的序列(表1)。采用BLAST進行序列比對,結合文獻選擇模式菌株,下載對應的基因序列。對ITS(1-485)、LSU(486-1387)、RPB2(1388-2009)和TUB(2010-2265)進行串聯(lián)加合,總長為2 265 268個的變異位點(variable characters,VC)是簡約信息位點(parsimony-uninformative),信息位點數(shù)(parsimony-informative characters)為938個。樹長為1725。采用PAUP v 4.0b10進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建,系統(tǒng)發(fā)育樹參數(shù)如下:Consistency index(CI)=0.793,Homoplasy index(HI)=0.206,Retention index(RI)=0.806,Rescaled consistency index(RC)=0.639,CGMCC 3.20225、EpicoccummackenzieiACCC 35051、EpicoccummackenzieiACCC 35053和EpicoccummackenzieiACCC 35054聚為一支(圖4)。外群為DidymellaamericanaCBS 185.85和DidymellaamericanaCBS 568.97。

表1 4個E.mackenziei菌株的基因或核酸序列

圖4 4個代表性菌株E.mackenziei的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 病原菌生物學特性

將6 mm的PDA菌碟轉移到PDA(圖5a～f)、MEA(圖5g～l)和OA(圖5m～r)培養(yǎng)基上,并在25 ℃和黑暗條件下培養(yǎng)。菌落在3種培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出豐富的菌絲體(圖5a～r)。

注:a～f:菌株接種至PDA(a～b,5 d; c～d,10 d; e～f,15 d; a,c和e,正面; b,d和f,反面);g～l:菌株接種至MEA(g～h,5 d; i～j,10 d; k～l,15 d; g,i和k,正面; h,j和l,反面);m～r:菌株接種至OA(m～n,5 d; o～p,10 d; q～r,15 d; m,o和q,正面; n,p和r,反面)。

CGMCC 3.20225菌株在PDA上培養(yǎng)5 d,菌落中央的顏色呈淺綠色(圖5-a),背面呈深紅色,邊緣有黃色圓圈(圖5-b);接種10 d或15 d,菌落顏色呈灰白色,背面邊緣呈黃色且逐漸擴大,中央的紅色逐漸加深(圖5c～f)。

接種菌株至MEA上生長5 d,菌落中央的顏色呈灰白色(圖5-g),背面中央呈紅褐色,邊緣呈黃色(圖5～h);接種10 d或15 d,菌落種養(yǎng)顏色逐漸加深,有黑色、黑褐色油滴狀、球狀物產(chǎn)生,半浸入在培養(yǎng)基表面,大小約100～2000 μm(圖5i～l)。

接種菌株至OA上生長5 d,菌落中央顏色呈白色(圖5～m),背面呈灰色(圖5～n)。接種10 d或15 d,菌落具有豐富的菌絲體,顯著多于菌株在PDA和MEA上(圖5o～r)。

CGMCC 3.20225、ACCC 35051、ACCC 35053和ACCC 35054菌株在MEA上的菌絲生長速率較高,其次是在OA和PDA上(圖6)。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

根據(jù)形態(tài)學鑒定、多基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析和致病性試驗的方法,本研究從貴州省思南縣、石阡縣和開陽縣的茶葉斑病中分離鑒定了致病菌E.mackenziei。目前,關于E.mackenziei的研究報道較少,E.mackenziei首先是從芒柄花(Ononisspinosa)壞死的莖上分離獲得,作者觀察了其子囊果、擬側絲、子囊、子囊孢子的形態(tài)特征,同時,通過系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)其與E.nigrum遺傳距離較近[25]。茶葉斑病的病原菌種類復雜,其致病機制及病害發(fā)生流行規(guī)律尚不清晰,本研究團隊先后從貴州茶區(qū)的茶葉斑病中分離出Didymellasegeticola、D.bellidis、E.sorghinum、E.nigrum,這些菌株均屬于Didymellaceae家族的成員[1,8,10-11]。此外,有研究表明E.layuense也可以引起茶葉斑病[26],同樣,本研究小組在開陽縣毛云鄉(xiāng)也發(fā)現(xiàn)了E.layuense引起茶葉斑病的樣本(E.layuenseACCC35052,ITS:OP975751,LSU:OP975775)。作為Didymellaceae家族的成員,D.segeticola、D.bellidis、E.sorghinum、E.nigrum和E.layuense雖然都可以導致茶葉斑病,但其癥狀略有不同。我們認為這可能與病原菌生物學特性、茶樹品種與抗病力、茶樹微生物群落等因素有關,這還需要進一步深入研究,以期為茶樹病害提供有效防治措施。