HDAC6調控在膿毒癥致急性呼吸窘迫綜合征中的研究進展

王萌 陳乾 李華

膿毒癥是感染引起的宿主反應失調,進而導致危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征,肺臟是最易受損的靶器官之一[1]。膿毒癥發生時,肺泡毛細血管膜通透性增加,炎癥細胞浸潤,形成嚴重肺水腫,最終導致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[2],而肺血管內皮細胞(pulmonary vascular endothelial cell,PVEC)是最早受損且損傷最嚴重的靶細胞[3]。ARDS全球發病率高,每年超過三百萬,且死亡率居高不下(34.9%～46.1%)[4-5]。近年來,越來越多的研究表明組蛋白乙酰化可通過炎癥抑制、細胞調控在ARDS中發揮保護性作用[6]。組蛋白乙酰化的狀態受組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的共同調節[7]。其中,HDAC6是HDAC家族中最大的蛋白質,且可通過調控非組蛋白底物及信號通路在細胞中發揮作用。本文就HDAC6在ARDS中的研究進展簡述如下。

一、膿毒癥致ARDS的病理機制

首先,許多研究表明膿毒癥中的早期氧化應激和過度的炎癥反應是ARDS的關鍵。膿毒癥期間刺激原激活P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,P38 MAPK)、細胞內核轉錄因子 κB(NF-κB)等炎癥通路,大量炎性細胞和細胞因子聚集,從而導致肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞受損,肺泡毛細血管膜通透性增加,形成肺水腫[7-8]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是細胞有氧呼吸的代謝產物,當體內活性氧生成過度,氧化應激增強,ROS可以與多種細胞因子相互作用,促進促炎細胞因子和粘附分子如ICAM-1/VCAM-1的表達,從而促進炎癥級聯反應的形成。同時,在內毒素誘導的ARDS動物模型中伴有NO、iNOS、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白細胞介素-1β (IL-1β)等主要炎癥介質的增加[9-10],也同樣證明全身炎癥反應失調是導致膿毒癥所致ARDS的病理基礎。其次,關于膿毒癥致ARDS的另一主要病理基礎是PVEC過度凋亡,造成肺血管內皮損傷。PVEC是幫助保持肺組織完整的重要屏障[11],其分泌的多種介質(TNF,VEGF,ET-1,PGI-2,NO等)可激活炎癥反應、加速EC膜表達黏附分子、增強促凝血途徑、還可以造成肺泡-毛細血管屏障的改變[12]。通過以上途徑引發肺實質的損傷,出現不可逆的急性呼吸窘迫綜合征。在ARDS患者的肺部超微結構中可觀察到內皮細胞的凋亡和壞死[13]。

二、組蛋白乙酰化概述

HAT和HDAC在氣道中廣泛表達,它們分別調節組蛋白乙酰化和去乙酰化[14]。一般情況下,HAT與HDAC處于動態平衡中,一旦失衡,將會促進炎癥、腫瘤、代謝紊亂等多種疾病的發展[15-16]。脫氧核糖核酸和組蛋白是染色質的主要組成部分,染色質的緊密結構是靠正負電荷的互相吸引。組蛋白乙酰化發生時,HAT將乙酰輔酶A(CoA)的乙酰基轉移到組蛋白N端賴氨酸殘基上,帶負電荷的乙酰基與帶正電荷的賴氨酸殘基互相結合,造成組蛋白和DNA連接疏松,以增強 DNA的轉錄[17-18];與HAT作用相反,HDAC可將賴氨酸殘基上乙酰基去除,促使DNA和組蛋白緊密結合,導致染色質結構致密,從而抑制DNA的轉錄。真核生物中已經發現18種HDAC,根據不同同源基因和結構域被分為4大類:Ⅰ類(與Rpd3同源的HDAC1、2、3和8)、Ⅱ類(與HDA1同源的HDAC 4、5、6、7、9和10)、Ⅲ類 (與SIR2同源的SIR1、2、3、4、5、6和7)和Ⅳ類(HDAC11)[19]。而Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類是Zn2+依賴性脫乙酰化酶。

三、HDAC6與膿毒癥致ARDS

1 HDAC6結構組織和亞細胞定位

HDAC6蛋白由1215個氨基酸組成,是HDACs家族中最大也是最獨特的一員。首先,其定位特殊:絕大部分HDAC酶只定位在細胞核,而HDAC6功能域的核輸出信號(nuclear export signal,NES)和絲氨酸-谷氨酸的四肽基序(SE14)使其也可穩定存在于細胞質中。并且,當細胞增殖停止時,核定位信號(nuclear localization signal,NLS)將一部分蛋白質移位到細胞核中,這使HDAC6具有更強的脫乙酰能力[20]。其次,其結構特殊:HDAC6是唯一含有兩個完整催化結構域(DD1和DD2)的HDACs,并且這兩個同源脫乙酰酶結構域可獨立地對HDAC6蛋白的整體活性起作用。位于羧基末端的鋅指結構域(ZnF-UBP結構域,也稱為BUZ)可與游離泛素以及單體泛素和多聚泛素蛋白高親和力結合。因此,HDAC6至少在兩種細胞信號通路的交叉點上起作用,包括依賴于DD1和DD2的去乙酰化酶作用和依賴于BUZ的泛素結合功能(見圖1)[21-22]。

圖1 HDAC6的功能結構域示意圖

2 HDAC6的生理作用

HDAC6可通過催化多種底物的去乙酰化而表現出不同的功能,而在體內更傾向于表現為非組蛋白酶活性。DD1和DD2通過將α-tubulin、Cortactin、HSP90、Ku70和過氧化物還原蛋白(peroxiredoxin Ⅰ and Ⅱ,Prx Ⅰ/Ⅱ)等多種非組蛋白酶活性底物脫去酰基而參與細胞的增殖、遷移和死亡、免疫反應、轉錄、錯誤折疊蛋白的降解和應激反應等[23]。這些生理作用主要受細胞骨架動力學的控制,細胞骨架由微管(MT)、中間絲(由纖維蛋白組成)和絲狀肌動蛋白(球狀f-肌動蛋白聚合物或g-肌動蛋白)組成。α-tubulin是第一個被證實的 HDAC6 去乙酰化底物,其可逆的乙酰化水平與MT的穩定性和功能密切相關。例如:HDAC6在哺乳動物細胞中的過表達會導致MT蛋白處于低乙酰化水平,并促進趨化性細胞運動;相反,抑制HDAC6功能會使MT蛋白超乙酰化,抑制成纖維細胞的活力[20]。

肌動蛋白(actin)的聚合和交聯是由皮質肌動蛋白(Cortactin)促進的。Cortactin可在其F-actin結合重復序列內被p300/CBP相關因子(PCAF)乙酰化,F-actin的形成促進了自噬體-溶酶體融合和底物降解。因此,HDAC6不僅可調節MT細胞骨架,也可調節肌動蛋白,而這也是維持血管內皮屏障穩定的重要組成部分[24-25]。

HDAC6一般通過激活自噬-溶酶體途徑(ALP)的發生、促進蛋白質聚集體的形成、介導分子伴侶HSP90的活化三種途徑參與錯誤折疊蛋白的降解[26-28],蛋白質聚集體中的泛素會招募 HDAC6,從而促進依賴Cortactin的F-actin重塑和隨后的自噬體-溶酶體融合[28];此外,HSP90的乙酰化會使分子伴侶的活性喪失從而導致其結合蛋白質被降解。

Ku70是一種可在非同源末端連接 DNA 修復中結合 DNA 雙鏈斷裂的核因子,HDAC6調控其與促凋亡Bax蛋白(Bc1-2相關X蛋白)相互作用。當Ku70被乙酰化時,它不再與Bax相互作用,Bax隨后激活細胞凋亡。此外,HDAC6還參與PI3K/AKT/ERK信號通路,HDAC6的下調會抑制AKT和ERK去磷酸化從而抑制細胞增殖與分化,誘導細胞死亡[29]。

HDAC6在調控H2O2相關壓力所引起的細胞反應中扮演重要角色。HDAC6是氧化還原調節蛋白、過氧化還原蛋白Prx Ⅰ和 Prx Ⅱ的特異性脫乙酰酶。當HDAC6被抑制時,乙酰化的 Prxs 聚集,Prx 的乙酰化增加了H2O2還原活性及超氧化物抗性[30]。

因此,HDAC6與上述反應途徑蛋白相互作用為它們在疾病病理和生理機制層面上提供了治療靶點。

3 HDAC6抑制可改善膿毒癥致ARDS

目前認為,組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)本質上是固有免疫細胞中關鍵免疫受體表達和抗菌作用的負性調節因子,可以降低巨噬細胞對細菌的吞噬和殺傷作用,提高機體對非嚴重感染的易感性。當機體發生膿毒癥和膿毒癥休克等嚴重感染時,HDACIs 可以保護肺組織細胞免受致命性的炎癥損傷。Tubastatin A 是迄今為止最有效的 HDAC6 抑制劑[31]。HDACIs 對膿毒癥及相關肺損傷的保護作用可能通過以下途徑實現。

(1)HDAC6抑制可減輕肺部炎癥反應

膿毒癥早期的特點是過度的炎癥反應,導致“細胞因子風暴”。這種細胞因子風暴之后是一段長時間的相對免疫抑制。這兩個階段都會增加膿毒癥的死亡率。炎癥過程始于嗜中性粒細胞的流入,隨后是單核細胞的募集,然后單核細胞分化成炎性巨噬細胞或樹突狀細胞。這些細胞是炎癥部位的關鍵效應細胞,識別并吞噬病原體和壞死細胞以幫助消除感染。中性粒細胞和巨噬細胞的激活同為ARDS 免疫及炎癥反應的病理標志。

HDAC6抑制可以阻斷炎癥信號通路并減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的急性肺部炎癥[32]。Rosenjack等[33]對LPS 誘導膿毒癥小鼠的研究發現,抑制HDAC6后,小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細胞百分比顯著降低,且恢復MT乙酰化、細胞內運輸并減少炎癥信號傳導。Zhang L.等[34]通過盲腸結扎穿孔 (CLP) 誘導的膿毒癥小鼠模型發現,與未經HDACIs預處理的空白組小鼠相比,HDACIs組小鼠肺組織的中性粒細胞浸潤減少、血漿 IL-6水平降低、肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平下降,ICAM-1和 E-選擇素的表達顯著減少; CLP 小鼠的存活時間顯著延長,膿毒癥所致肺損傷顯著減輕。Zhang W.B.等[35]研究后發現,HDAC6抑制劑可阻斷 ROS 的過量產生,并抑制LPS 激活的巨噬細胞中促炎細胞因子如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表達。核轉錄因子紅系2相關因子2(Nrf2)在抑制ROS誘導的炎癥反應中起重要作用[36]。Nrf2可以調節其下游相關靶基因血紅素氧合酶-1(HO-1)以發揮其抗氧化應激的作用。此外,HO-1的表達可以抑制促炎細胞因子在巨噬細胞中的產生[37]。Thangavel等[38]發現,在LPS誘導的膿毒癥小鼠模型早期,組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Trichostatin A,TSA)和DNA甲基化酶抑制劑(5-Aza 2-deoxycytidine,Aza)的聯合預處理可減少肺組織炎癥并促進M2型巨噬細胞極化,提高抗炎反應。由此可見,與炎性反應有關的轉錄因子、細胞內信號分子、細胞因子受體等均受到乙酰化調節,因而HDACIs可影響炎癥性疾病的發生發展,為膿毒癥致ARDS的治療提供了一條新的途徑。

(2)HDAC6抑制可降低膿毒癥誘導的內皮細胞高滲透性

內皮屏障功能障礙是一種血管對炎癥的反應,會導致血管通透性增加,血管內外液體交換失衡,它的功能障礙可導致富蛋白質水腫的發生,常伴隨發生于ARDS[39]。MT、肌動蛋白細胞骨架和細胞間連接(粘著連接AJ,緊密連接TJ)是維持內皮屏障完整性所需的關鍵成分。MT結構的主要蛋白組成成分為α-和 β-tubulin,HDAC6介導的tubulin去乙酰化會導致MT解聚,穩定性降低,而通過抑制HDAC6增強tubulin乙酰化可降低膿毒癥誘導的內皮屏障高通透性[40]。諾考達唑是一種MT去穩定劑,可以在肺血管內皮細胞中誘導產生內皮細胞屏障功能障礙;而使用MT穩定劑紫杉醇的靜脈內給藥可改善 EBD 和LPS致肺損傷所產生的炎癥[41]。

此外,MT與肌動蛋白細胞骨架的相互作用在調節內皮通透性方面也發揮著積極作用。Rho是MT和肌動蛋白骨架之間的信號傳導中間體,通過抑制HDAC6可下調Hsp90 依賴性RhoA 活性和信號傳導,然后通過抑制肌動蛋白細胞骨架重組和細胞收縮改變內皮通透性[42]。

AJ是細胞間連接的重要組成部分,在維持細胞屏障完整性也發揮著重要作用。VE-cadherin蛋白和β-catenin蛋白是 AJ 復合物的兩個主要成分。β-catenin 蛋白在細胞-細胞連接處與VE-cadherin相互作用,以支持內皮屏障完整性。β-catenin去乙酰化會誘導β-catenin核轉位和 AJ 的解聚,而抑制 HDAC6 可恢復 β-catenin 乙酰化來降低膿毒癥誘導的內皮屏障高滲透性[43]。

半胱天冬酶(Caspases)的激活在內皮細胞屏障功能障礙發生過程中也起著重要作用。其主要機制包括介導細胞凋亡和改變細胞連接蛋白如ZO-1和VE-cadherin排序。MT破壞會導致凋亡信號傳導和Caspases激活增加。抑制Caspases可有效減輕膿毒癥致ARDS小鼠模型的肺部損傷[44]。

目前,有多項研究證明HDAC6抑制可有效減輕肺內皮細胞屏障功能障礙。Thangavel等[45]研究表明,在 LPS 誘導的小鼠ARDS模型中,TSA的干預可降低死亡率并改善肺血管內皮細胞的完整性。Joshi等[42]提出HDAC6 抑制劑通過抑制 Hsp90 依賴性 RhoA活性和信號傳導,可減輕與 LPS 誘導的小鼠 ARDS 相關的炎癥、毛細血管通透性和結構異常。Yu等[46]觀察到與對照組相比,用HDAC6抑制劑預處理組的膿毒癥小鼠肺血管內皮細胞連接蛋白表達改善,肺水腫減輕。綜上,HDAC6抑制是一種可以調節炎癥性肺損傷中內皮細胞連接穩定性的新方法。

(3) HDAC調控miRNA參與膿毒癥誘導的ARDS

miRNA 是一組進化上保守的小型內源性非編碼 RNA,它們通過對其靶轉錄物的序列特異性識別來協調哺乳動物基因的表達。miRNA 參與許多病理生理過程,例如調節細胞增殖、分化、凋亡、代謝和免疫反應。

近年來研究發現,miRNA 與肺部疾病的發生發展和預后密切相關,包括肺炎、肺癌、肺纖維化等[47]。在ARDS 中,miRNA 可以通過靶向特定分子來調節炎癥和免疫反應[48-49]。目前與促炎相關的 miRNA 主要有miR-34a、miR-132、miR-155、miR-15a、miR-21、miR-27b和miR-146a等。膿毒癥合并ARDS患者血漿中miR-155的表達明顯高于膿毒癥但未合并ARDS的患者。膿毒癥合并ARDS患者的miR-155水平與IL-1β和TNF-α水平及ARDS評分呈正相關,與PaO2/FiO2呈負相關[50]。Jiang等發現miR-23a-3p升高促進LPS誘導的小鼠巨噬細胞M1極化,而抑制miR-23a-3p會導致巨噬細胞反應降低并改善肺部炎癥[51]。越來越多的證據表明,miRNA 在與血管生物學功能相關的多個生物學過程中發揮著重要作用,例如血管生成、內皮細胞功能和血管炎癥[52]。此外,Xu等[53]從小鼠骨髓基質干細胞 (BMSCs) 中分離出外泌體,使用LPS建立小鼠肺部炎癥模型,結果發現外泌體和miR-150減輕了炎癥和肺水腫,同時保持了肺泡結構的完整性;它們還可通過調節caspase-3、Bax/Bcl-2和MAPK信號傳導來減輕微血管內皮細胞損傷。小細胞外囊泡(sEV)治療會抑制肺血管內皮細胞凋亡,Li等[54]發現不止一種miRNA在調節sEV減輕 LPS 誘導的內皮屏障損傷方面發揮作用。

HDAC6與 miRNA 關系密切。Wildung 等[55]通過建立小鼠ARDS模型觀察纖毛相關基因與 miR449-/-表達變化的研究發現,用HDAC6 抑制劑處理的miR449-/-細胞具有更多和更長的呼吸纖毛,提示 HDACIs 可影響 miRNA 的表達。Li等[56]研究表明,Tubacin可增強DNM3os/miR-199a2 軸的表達,具有降低缺氧誘導因子(HIF-1α)和肺血管內皮細胞中的內皮素-l(ET-l)水平的有益結果。所以,HDAC6所調節的miRNA可能是ARDS 的診斷指標和治療靶點。

四、小結

ARDS是膿毒癥的常見臨床并發癥,極大地危害著人類健康,在過去十年中,膿毒癥療法的開發取得了一定進展,但死亡率仍然很高。因此,研究包括膿毒癥分子機制在內的發病機制對于設計膿毒癥預防和治療策略具有重要意義。HDAC6抑制主要通過抑制炎癥信號通道,減少炎癥因子的釋放來改善膿毒癥誘導的ARDS;HDAC6抑制還通過誘導α-tubulin和β-catenin乙酰化、增加β-catenin的膜定位,對其靶底物的影響來保護內皮屏障功能,從而導致MT和AJs的穩定;它還可以防止caspase-3活化,維持肺內皮細胞-細胞連接,抑制肌動蛋白應力纖維形成,并通過調節HSP90降低肌球蛋白輕鏈的磷酸化。此外,許多研究表明增加保護性miRNA的表達和抑制不利的miRNA可有效緩解ARDS,一些miRNA還被證明是ARDS的生物標志物。而HDACIs可通過miRNAs發揮其抗炎及抗凋亡作用。這些發現均支持HDAC6抑制是一種預防器官衰竭和改善膿毒癥預后的新型治療靶點。