宏基因組二代測序在肺結核診斷中的應用

唐小莉 戴廣川 高衛衛 陳珊珊 曾誼

目前我國每年新發肺結核患者約90萬例[1],結核病仍是我國傳染病死亡主要原因,及早診斷、及時治愈是消除傳染源、控制結核病流行及降低死亡率的最重要措施。目前的病原學診斷工具包括抗酸桿菌涂片、微生物培養、Xpert MTB/RIF(Xpert)、全基因組測序等分子檢測。mNGS是一種新型、快速、簡單、方便的臨床感染性疾病鑒定的檢測方法[2],只需一次運行即可無偏倚地獲得所有獲得微生物核酸片段的序列信息,通過分析和比較可鑒定所有微生物物種[3]。在這項研究中,我們回顧性分析91例疑似肺結核患者BALF的傳統病原體檢測方法與mNGS結果并進行對比,評估mNGS在肺結核診斷中的臨床價值。

資料與方法

一、一般資料

收集2020年12月至2021年6月在南京市第二醫院收治的91例疑似肺結核患者,從每位患者的BALF中取樣分別送檢mNGS(諾因生物,南京)、涂片、培養、Xpert,參照《肺結核診斷》(WS 288—2017)[4]以確定最終臨床診斷,包括臨床診斷肺結核和確診肺結核。

二、納入及排除標準

納入標準:(1)門診經痰涂片初步篩查為陰性的疑似肺結核患者。(2)臨床資料完整無缺失。(3)臨床樣本和檢測過程通過mNGS的質量控制。

排除標準:(1)臨床和實驗室資料不完整。(2)診斷不明確。(3)臨床樣本未通過 mNGS 質量控制。(4)樣品泄漏和污染。

本研究所有患者均已獲得知情同意書,并通過南京市第二醫院倫理委員會審批(2021-LY-kt073)。

三、方法

1 標本采集:納入患者的BALF。2 常規檢測方法:涂片按照《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質量保證手冊》進行。培養采用BACTECMGITTM960分枝桿菌快速培養法[5]。Xpert按照利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測系統儀器使用說明書進行操作(美國Cepheid公司),檢測結果自動判讀。3 mNGS:根據標準程序采集納入患者的BALF 1.5～3 mL,儲存無菌凍存管中,24小時內進行檢測。樣本按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316,Tiangen Biotech)試劑盒步驟提取DNA處理產生200～300 bp片段,通過PCR 擴增和環化反應產生單鏈環來構建文庫,Agilent 2100 用于質量控制,通過 BGISEQ-200平臺對質量確認的文庫進行測序,排除人源序列后的其余數據與KnoinDXTM建立的基于NCBI(GenBank/RefSeq/NT)的微生物參考數據庫對比進行高級數據分析。本研究使用的參考數據庫包含10216 種細菌、5875 種病毒、3789 種真菌和432 種寄生蟲。結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)陽性mNGS 結果的閾值標準:MTB是一種胞內分枝桿菌病原體,核酸提取困難,且BALF污染可能性小,因此當至少1個讀數被映射到種水平時MTB被認為是陽性[6]。

四、統計學分析

非正態分布的連續變量表示為中位數(四分位數間距),正態分布的連續變量表示為均值(標準差),分類變量表示為n(%)。組間差異采用Mann-WhitneyU檢驗、卡方檢驗或Fisher精確檢驗。以臨床最終診斷為參考標準,建立 2×2 列聯表以確定敏感度、特異度、陽性預測值 (PPV) 和陰性預測值 (NPV),結果以 95% 置信區間 (CI)表示,mNGS與其他檢測方法的敏感差異性用Mcnemar χ2檢驗。使用SPSS 25.0軟件、MedCalc V19.0.7.0軟件和Graphpad Prism 8軟件進行數據分析。P<0.05 為具有統計學意義,所有檢驗均采用雙尾檢驗。

結 果

一、患者基本信息

共有91名患者符合本研究的納入標準,男性53例(58.24%),年齡中位數(四分位區間)為52.00(28.50,63.00)歲;女性38例(41.76%),年齡均值(標準差)為(51.00±16.88)歲。其中73例 (80.22%) 診斷為肺結核,男性43例(58.90%),年齡中位數(四分位區間)為49.00(26.00,63.00)歲,女性30例(41.10%),年齡均值(標準差)為(51.07±17.62)歲。18例(19.78%)患者診斷為非結核感染性疾病,男性10例(55.56%),年齡均值(標準差)為(55.40±17.43)歲,女性8例(44.44%),年齡均值(標準差)為(50.75±14.84)歲。兩組患者的年齡、性別、實驗室參數、癥狀等方面均無統計學差異(P>0.05)。

二、不同檢測手段在肺結核診斷中的效能

在73例肺結核患者中,mNGS共檢出MTB陽性28例。mNGS與涂片、培養、Xpert檢出均陽性的病例僅1例;mNGS與涂片均陽性為9例、與培養均陽性為6例、與Xpert均陽性為17例;僅mNGS陽性為9例,僅涂片陽性為1例,僅Xpert陽性為12例。mNGS診斷肺結核的敏感度和特異度分別為38.36%(95%CI0.272～0.505)和100.00%(95%CI0.815～1.000),PPV和NPV分別為100.00% (95%CI0.877～1.000)和28.57% (95%CI0.179～0.413);涂片法的敏感度和特異度分別為15.07%(95%CI0.078～0.254)和77.78%(95%CI0.524～0.936);培養法的敏感度和特異度分別為10.96%(95%CI0.049～0.205)和100.00%(95%CI0.815～1.000);Xpert的敏感度和特異度分別為41.10%(95%CI0.297～0.532)和94.44%(95%CI0.729～0.999)。本組研究結果示mNGS敏感度略低于Xpert,兩者之間無顯著性差異(38.36%vs41.10%,P=0.84;);與涂片和培養相比,mNGS的敏感度分別增加(38.36%vs15.07%;P<0.001),(38.36%vs10.96%;P<0.001),其P值均<0.001,兩者之間存在顯著性差異。將Xpert和mNGS兩種快速診斷方法結合起來,發現可有效提高肺結核檢測的敏感度,其敏感度可達56.16% (95%CI0.441～0.678),聯合診斷效能優于四種方法中的任何一種(表1)。

表1 mNGS與涂片法、MTB培養、Xpert在肺結核診斷中的比較(%)

三、不同檢測手段在肺結核復診患者中的診斷效能

將所有納入的91例疑似肺結核病患者根據有無抗結核治療史分為初診病例和復診病例兩組。與初診病例相比,復診病例組的涂片(20.00%vs7.14%,P=0.07)和mNGS(57.14%vs42.86%,P=0.19)檢測敏感度提高,培養(14.29%vs16.07%,P=0.82)和Xpert(22.86%vs39.29%,P=0.11)檢測敏感度降低,但均無顯著性差異。其復診病例中,mNGS的敏感度為57.14%,涂片的敏感度為20.00%,培養的敏感度為14.29%,Xpert的敏感度為22.86%。mNGS與涂片(57.14%vs20.00%,P<0.001)、培養(57.14%vs14.29%,P<0.001)、Xpert(57.14%vs22.86%,P<0.001)之間的敏感度對比均有顯著性差異(表2)。

表2 mNGS與涂片、MTB培養、Xpert在初診與復診病例中的敏感度比較[n(%)]

四、不同檢測手段對不同抗結核治療時間復診患者的診斷效能

在35例復診患者中,根據患者抗結核治療是否超過6個月分為兩組。抗結核治療時間 ≤ 6個月的患者中,mNGS敏感度分別與涂片(61.54%vs38.46%,P=0.38)、培養(61.54%vs23.08%,P=0.18)、Xpert(61.54%vs53.85%,P=1.00)均未有顯著性差異,且mNGS與涂片、培養、Xpert的聯合診斷敏感度相當(61.54vs76.92%,P=0.63);但在抗結核治療時間 >6個月的患者中,mNGS的敏感度為54.55%,涂片的敏感度為9.09%,培養的敏感度為9.09%,Xpert的敏感度為4.55%,涂片、培養、Xpert的聯合診斷敏感度為22.73%。mNGS敏感度與涂片(54.55%vs9.09%,P<0.001)、培養(54.55%vs9.09,P<0.001)、Xpert(54.55%vs4.55,P<0.001)的P值均<0.001,兩者之間均有顯著性差異,且mNGS敏感度大于涂片、培養、Xpert的聯合診斷(54.55%vs22.73%,P=0.07)。而且,在抗結核治療時間≤6個月的患者中,MTB與其他病原體混合感染占比15.38%(2/13);非結核感染患者占比15.38%(2/13),培養和mNGS各檢出1例致病菌;在抗結核治療時間>6個月的患者中,MTB與其他病原體混合感染占比27.27%(6/22);非結核感染患者占比36.36%(8/22),mNGS均檢出非結核感染患者的致病菌,涂片與Xpert均未檢出,培養僅檢出2例(表3)。

表3 mNGS與涂片、MTB培養、Xpert在不同抗結核治療時間復診病例中的敏感度比較[n(%)]

五、mNGS對肺結核合并混合感染的診斷效能

在73例肺結核患者中,mNGS結合常規檢查方法共診斷出混合感染18例(24.66%)。7例為MTB和真菌混合感染(黑曲霉1例、隱球菌1例、白色念珠菌1例、土曲霉2例、煙曲霉2例),3例為MTB和常見細菌混合感染(副流感嗜血桿菌1例、肺炎克雷伯桿菌1例、巴西奴卡菌1例),5例為MTB和非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium,NTM)混合感染(鳥分枝桿菌2例、胞內分枝桿菌1例、龜分枝桿菌2例),2例為MTB和病毒混合感染(人皰疹病毒1例、戊肝病毒1例),1例為MTB和真菌、病毒混合感染(出芽短梗霉、人皰疹病毒)。混合感染患者中,除MTB外其它病原體均由mNGS檢出。其中6名患者(6/18,33.33%)僅使用mNGS方法同時檢測出MTB、真菌和NTM(隱球菌、白色念珠菌各1例,鳥分枝桿菌2例、胞內分枝桿菌1例、龜分枝桿菌1例)。整體而言,與常規培養和Xpert相比,mNGS在鑒定混合感染、NTM菌種以及真菌、病毒檢測方面具有明顯優勢。

討 論

目前,傳統病原微生物檢測方法在臨床肺結核病的診斷中仍在廣泛應用,但在敏感度、特異度、時效性及信息量等方面存在一定的局限性,尤其對未知或罕見病原體無法進行快速識別。其中抗酸染色涂片法僅能提示分枝桿菌感染,其靈敏度僅30%,且無法對MTB與NTM進行判別。MTB培養法雖敏感性有所提高,但需2～6周才能提供檢測結果。Xpert通過rpoB基因互補的探針雖然在2小時內能同時識別MTB和利福平(RIF)耐藥性[7],但無法檢測NTM及進行菌種鑒定。本研究結果顯示mNGS與涂片、MTB培養相比,在肺結核診斷中敏感度具有顯著性差異(38.36%vs15.07%;P<0.01;38.36%vs10.96%,P<0.01),這與之前的研究一致[8-9];與Xpert相比,其敏感性略低,但兩者之間無顯著性差異(38.36%vs41.10%,P=0.84)。將Xpert和mNGS聯合診斷進行分析,數據表明有效提高結核病檢測的敏感度。在時效性方面mNGS周轉時間為24小時,長于Xpert 2小時,明顯短于MTB培養,與涂片時間相當。整體而言,在肺結核的早期診斷中mNGS較傳統病原學檢測方法具有一定優勢,尤其與Xpert聯合診斷時敏感度更高。

本研究結果顯示mNGS有助于肺結核患者的混合病原體診斷及非結核患者的其他病原體診斷,與之前mNGS對混合肺部病原體檢測具有比常規檢測更高的靈敏度[10-11]的相關報道相符。病毒檢測常需臨床醫生預判并進行相關血清免疫學及PCR核酸檢測[12]進行診斷,在本研究中發現的兩例病毒感染僅通過mNGS得到鑒定,本結果進一步突出mNGS在識別單個標本中致病病原體方面的優勢,本組標本尤其在鑒定NTM菌種、真菌與病毒方面具有優越的可行性,與mNGS在結核、真菌、病毒診斷方面比傳統培養更有優勢[6]。機體被結核感染后細胞免疫功能受損易繼發NTM、真菌(曲霉、肺孢子菌、隱球菌等)、病毒(巨細胞病毒、單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、軍團菌、諾卡菌等感染[13],鑒于相關致病菌核酸提取率低,故在無菌操作獲取的BALF標本中檢測出的上述病原體盡管序列數低仍需考慮其致病可能[14],且由于抗菌藥物使用對mNGS的影響小于傳統培養,故建議根據檢測結果可以進行抗菌藥物治療方案的調整[6]。文獻報道肺結核死亡的主要原因中肺結核合并感染死亡率最高[15]。mNGS可以早期發現可能致病病原體,指導抗菌藥物的精準選擇,從而有望降低肺結核患者的病死率,但尚需要大樣本的研究證實。

由于抗結核藥物抑制了結核菌的生長,故有結核藥物治療史的患者常規涂片、培養法MTB陽性檢出率較無治療史者降低,而mNGS檢出MTB陽性率無顯著差異[16]。我們根據患者有無抗結核治療史將所納入患者分為初診病例和復診病例兩組,我們的結果也表明,mNGS檢出效率不受之前使用抗結核藥物的影響(57.14%vs42.86%,P=0.19)。在復診病例中,除mNGS與涂片、培養的檢測效率均有顯著性差異外,mNGS與Xpert也存在顯著性差異(57.14%vs22.86%,P<0.01),我們數據表明mNGS可有效提高復診病例的診斷效率。在復診病例的基礎上,根據患者抗結核治療時間是否超過6個月進一步分為兩組。發現在抗結核治療時間≤ 6個月患者中,各檢查方法敏感度相當,而在>6個月的患者中mNGS敏感度均大于涂片、培養、Xpert及三者的聯合檢測,同時非結核感染患者(36.36%vs15.38%)及MTB與其他病原體混合感染患者(27.27%vs15.38%)占比均高于與對照組,提示規范抗結核治療后MTB被有效扼殺,同時因結核感染后肺部結構改變,局部廓清功能及免疫功能下降易繼發混合感染。數據表明mNGS可有效提高復診病例的診斷效率,評估是否復發,為復診患者及時精準診治提供了一種可能,且可能更適用于抗結核治療時間>6個月的復診患者,避免了非活動性肺結核患者的過度治療,同時可成為復診患者分診指標,以決定患者是否能入住非結核病定點醫療機構就醫。

綜上所述,mNGS在肺結核早期診斷中敏感度優于涂片法、培養法,與Xpert檢測相當,與Xpert聯合診斷敏感度更高;在肺結核合并混合感染方面具有優勢;可用于肺結核復診患者評估是否復發,值得推廣應用。在這項回顧性研究仍有許多局限性。首先,由于樣本量小,有部分結果表明了一定的趨勢,但沒有達到差異顯著性。因此,未來需要納入更多的患者進行研究。其次,本研究只進行了mNGS DNA檢測,未進行 RNA 測序;因此有可能遺漏一些RNA病毒。最后,mNGS目前尚缺乏統一的標準來確定檢測到的病原微生物是否來自感染、定植或污染,故結果需與臨床相結合。