蒼術(shù)素調(diào)節(jié)Notch信號對EGFR-TKI耐藥的非小細胞肺癌細胞株H1975增殖、凋亡的影響

張琳 朱琳 李晨

肺癌仍是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占大多數(shù)[1]。雖然在過去的十年中,NSCLC在篩查、診斷和治療方面均取得了顯著進展,但由于NSCLC早期癥狀不典型,多數(shù)患者確診時已處于疾病晚期,無法進行手術(shù)治療,導(dǎo)致患者生存時間仍較短[2-3]。另外,隨著表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)的上市,盡管EGFR突變的晚期NSCLC患者治療療效有所提高,但耐藥成為了EGFR-TKI治療的瓶頸,絕大部分患者經(jīng)一線治療后數(shù)月即出現(xiàn)疾病進展[4-5]。因此,開發(fā)新的治療藥物以降低EGFR-TKI耐藥性是NSCLC患者有效治療的關(guān)鍵,也是目前NSCLC治療的熱點和難點問題。近年來,天然中草藥因其高效、低毒等優(yōu)勢而在各個研發(fā)領(lǐng)域廣受歡迎。蒼術(shù)素作為茅蒼術(shù)根莖所含精油中的一種活性成分,其抗肺纖維化[6]、抗炎[7]、抗癌[8]等作用已被報道。然而,蒼術(shù)素對EGFR-TKI耐藥NSCLC的作用及分子機制尚不明確。此外,已有研究表明在EGFR-TKI治療下EGFR突變肺腺癌的Notch改變可導(dǎo)致組織學(xué)小細胞癌轉(zhuǎn)化[9];在EGFR-TKI治療后,一半EGFR突變的NSCLC腫瘤組織中Notch1和HES1上調(diào),且Notch抑制劑可削弱體外和體內(nèi)奧希替尼(三代EGFR-TKI)耐藥性,并表明Notch抑制劑和奧希替尼聯(lián)合可能是EGFR突變NSCLC的潛在治療方法[10]。基于此,本研究以人肺腺癌細胞H1975為研究對象,探討蒼術(shù)素對EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞增殖、凋亡的影響以及Notch信號通路在此過程中的作用。

資料與方法

一、主要材料

1 實驗細胞 人NSCLC細胞系H1975細胞(人肺腺癌細胞,ATCC-172)、人正常肺上皮細胞BEAS-2B(ATCC-539)來源于美國ATCC公司。將H1975細胞重懸于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞融合度達到80%左右時進行消化傳代,2～3 d換液一次,取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2 主要試劑 蒼術(shù)素(純度:HPLC≥98%,B20128-20 mg)購自上海源葉生物科技有限公司;Notch抑制劑1(一種Notch抑制劑,純度99.81%,HY-12860)購自美國MCE公司;MTT試劑(FS-RT2568)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(FS-E9680)購自上海撫生實業(yè)有限公司;膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒(FY600003-20T)購自上海弗元生物科技有限公司;cDNA鏈合成試劑盒(XY-PCR-1590)購自上海烜雅生物科技有限公司;TRIzol試劑(LM-0010)、熒光定量PCR MasterMix(SYBR Green)(LM-0017)、RIPA裂解液(LM801001C)購自上海酶聯(lián)生物工程有限公司;ECL發(fā)光試劑(WBKlS0100)購自美國Millipore公司;兔源一抗Notch1(ab52627,1∶1 000)、Notch3(ab23426,1∶1 000)、Hes1(ab71559,1∶1 000)、HEY1(ab154077,1∶1 000)、β-actin(ab8227,1∶1 000)和二抗HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(ab205718,1∶3 000)購自英國Abcam公司。

二、實驗方法

1 EGFR-TKI耐藥細胞株構(gòu)建 以人肺腺癌細胞H1975為親本細胞,采用低濃度逐步加量誘導(dǎo)法構(gòu)建EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/吉非替尼耐藥(gefitinib resisitant,GR)[11],具體操作為:將處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的親本細胞H1975接種于24孔板中,第1 d添加0.5 μmol/L吉非替尼,第2 d添加1.0 μmol/L吉非替尼,第3 d添加1.5 μmol/L吉非替尼,第4 d添加2.0 μmol/L吉非替尼,以后每天均添加2.0 μmol/L吉非替尼進行培養(yǎng),直到添加吉非替尼后細胞不會出現(xiàn)死亡為止,此時說明EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR構(gòu)建成功。

2 MTT法檢測親本細胞H1975和耐藥細胞H1975/GR對吉非替尼的敏感性以及蒼術(shù)素對H1975、H1975/GR細胞的毒副作用 將處于對數(shù)生長期的H1975和H1975/GR細胞以每孔5000個細胞接種于96孔板中(每孔100 μL),待細胞貼壁后添加不同濃度吉非替尼(終濃度為0、0.1、0.5、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μmol/L),其中0 μmol/L吉非替尼處理組為對照組,在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后每孔添加20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值(OD490 nm),計算細胞存活率以及吉非替尼抑制細胞增殖的半數(shù)抑制濃度(IC50)。細胞存活率(%)=實驗組OD490 nm/對照組OD490 nm×100%。

將處于對數(shù)生長期的BEAS-2B、H1975和H1975/GR細胞以每孔5000個細胞接種于96孔板中(每孔100 μL),待細胞貼壁后添加不同濃度蒼術(shù)素(終濃度為0、10、20、40、60、80 μmol/L)[12],其中0 μmol/L蒼術(shù)素處理組為對照組,常規(guī)培養(yǎng)48 h后每孔添加20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀檢測各孔的OD490 nm,計算細胞存活率。

3 細胞分組與藥物干預(yù) H1975/GR細胞分為正常組、蒼術(shù)素(低、中、高)濃度組、Notch抑制劑組。其中,正常組細胞不添加任何藥物;蒼術(shù)素(低、中、高)濃度組細胞分別添加終濃度為20、40、60 μmol/L的蒼術(shù)素;Notch抑制劑組細胞添加終濃度為7.8 nmol/L的Notch抑制劑1[13]。

4 MTT法檢測各組H1975/GR細胞增殖活力 H1975/GR細胞以每孔5000個細胞接種于96孔板中(每孔100 μL),待細胞貼壁后按照實驗方法3中分組與處理方法進行干預(yù),常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔添加20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)2 h后使用酶標(biāo)儀檢測各孔的OD490 nm,并以O(shè)D490 nm表示細胞增殖活力。

5 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞周期分布 H1975/GR細胞以每孔5×105個接種到6孔板中(每孔2 mL),待細胞貼壁后按照實驗方法3中方法干預(yù),常規(guī)培養(yǎng)48 h收集細胞,并將細胞重懸于PBS溶液中,計數(shù)1×106個細胞,添加500 μL PI染色液室溫避光染色20 min,使用流式細胞儀自帶軟件分析細胞周期。

6 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞凋亡率 H1975/GR細胞以每孔5×105個接種到6孔板中(每孔2 mL),待細胞貼壁后按照實驗方法3中方法干預(yù),常規(guī)培養(yǎng)48 h收集細胞,PBS洗滌后加入Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞,隨后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液室溫避光染色15 min,使用流式細胞儀自帶軟件分析細胞凋亡率。

7 qRT-PCR檢測各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關(guān)基因表達水平 收集按照實驗方法3中方法干預(yù)48 h后的各組H1975/GR細胞,TRIzol試劑提取細胞中總RNA,并按cDNA鏈合成試劑盒說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后以cDNA為模板,將其與基因特異性引物(引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成,引物序列見表1)和熒光定量PCR MasterMix(SYBR Green)等試劑相混合配制qRT-PCR反應(yīng)體系,最后置于qRT-PCR儀上擴增。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法定量分析細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平。

表1 引物序列信息

8 Western Blot檢測各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關(guān)蛋白表達水平 收集按照實驗方法3中方法干預(yù)48 h后的各組H1975/GR細胞,使用RIPA裂解液充分裂解提取細胞中總蛋白,BCA法測定蛋白濃度并加熱煮沸使蛋白變性。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白,并在切膠后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5% BSA室溫封閉膜1 h,隨后加入一抗(Notch1、Notch3、Hes1、HEY1、β-actin抗體)4℃冰箱中孵育過夜,PBST洗滌后加入二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG)37℃培養(yǎng)箱中孵育45 min,ECL發(fā)光試劑顯色。以β-actin為內(nèi)參,Image J軟件半定量分析蛋白條帶灰度。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、親本細胞H1975和耐藥細胞H1975/GR對吉非替尼的敏感性

與0 μmol/L吉非替尼比較,(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μmol/L)吉非替尼均可顯著降低H1975細胞存活率(P均<0.05),而(10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μmol/L)吉非替尼可顯著降低H1975/GR細胞存活率(P均<0.05)(見表2)。經(jīng)計算,吉非替尼抑制H1975/GR細胞的IC50為(24.84±2.37)μmol/L,顯著高于抑制H1975細胞的IC50[(13.05±1.86)μmol/L](t=9.586,P<0.05)。表明本研究所構(gòu)建的EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR可以用于后續(xù)實驗。

表2 不同濃度吉非替尼干預(yù)后H1975和H1975/GR細胞存活率比較

與0 μmol/L蒼術(shù)素比較,80 μmol/L蒼術(shù)素可顯著降低BEAS-2B細胞存活率(t=9.048,P<0.001),而(20、40、60、80 μmol/L)蒼術(shù)素均可顯著降低H1975、H1975/GR細胞存活率(tH1975細胞=8.828、15.967、22.195、28.151,tH1975/GR細胞=6.850、13.230、19.155、24.666,均P<0.001),且60、80 μmol/L蒼術(shù)素干預(yù)下,H1975/GR細胞存活率顯著高于H1975細胞(t=2.661、3.368,P=0.024、0.007)(見表3)。因此,選用20、40、60 μmol/L蒼術(shù)素作為低、中、高濃度進行下一步實驗。

表3 不同濃度蒼術(shù)素干預(yù)后BEAS-2B、H1975和H1975/GR細胞存活率比較

二、各組H1975/GR細胞增殖活力比較

藥物干預(yù)24 h后,與正常組比較,蒼術(shù)素(中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05);與蒼術(shù)素低濃度組比較,蒼術(shù)素高濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05)。藥物干預(yù)48 h、72 h后,與正常組比較,蒼術(shù)素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05),且蒼術(shù)素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術(shù)素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05)(見表4)。

表4 各組H1975/GR細胞增殖活力比較

三、各組H1975/GR細胞周期分布比較

與正常組比較,蒼術(shù)素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞中G0/G1細胞比例降低(P均<0.05),G2/M細胞比例升高(P均<0.05),且蒼術(shù)素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術(shù)素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中G0/G1細胞比例降低(P均<0.05),G2/M細胞比例升高(P均<0.05);與蒼術(shù)素高濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中G2/M細胞比例降低(P<0.05)(見圖1和表5)。

圖1 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞周期分布情況 A為正常組;B為蒼術(shù)素低濃度組;C為蒼術(shù)素中濃度組;D為蒼術(shù)素高濃度組;E為Notch抑制劑組

表5 各組H1975/GR細胞周期分布比較

四、各組H1975/GR細胞凋亡率比較

與正常組比較,蒼術(shù)素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞凋亡率升高(P均<0.05),且蒼術(shù)素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術(shù)素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞凋亡率升高(P<0.05)(見圖2和表6)。

圖2 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞凋亡情況 A為正常組;B為蒼術(shù)素低濃度組;C為蒼術(shù)素中濃度組;D為蒼術(shù)素高濃度組;E為Notch抑制劑組

表6 各組H1975/GR細胞凋亡率比較

五、各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關(guān)基因表達水平比較

與正常組比較,蒼術(shù)素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平降低(P均<0.05),且蒼術(shù)素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術(shù)素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平降低(P<0.05)(見表7)。

表7 各組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平比較

六、各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較

與正常組比較,蒼術(shù)素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達水平降低(P<0.05),且蒼術(shù)素各濃度組呈濃度依賴性(P<0.05);與蒼術(shù)素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達水平降低(P<0.05)(見圖3和表8)。

圖3 Western Blot檢測各組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達 泳道1為正常組;泳道2為蒼術(shù)素低濃度組;泳道3為蒼術(shù)素中濃度組;泳道4為蒼術(shù)素高濃度組;泳道5為Notch抑制劑組

表8 各組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達水平比較

討 論

EGFR-TKI靶向治療是晚期EGFR突變NSCLC患者一線治療的標(biāo)準(zhǔn)方式,可顯著改善患者預(yù)后,延長無進展生存期[14]。但使用EGFR-TKI治療期間不可避免地會出現(xiàn)耐藥性,獲得性耐藥已成為導(dǎo)致NSCLC患者治療失敗的重要原因,且這對患者和臨床醫(yī)生來說目前仍是一個重大挑戰(zhàn)[15]。因此,進一步闡明EGFR-TKI治療NSCLC的耐藥機制,并尋找新藥物靶點和開發(fā)新藥物成為臨床中急需解決的問題。

研究表明,蒼術(shù)素作為一種天然中草藥,具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性[16-17]。蒼術(shù)素對肺癌細胞A549、NCI-H23、NCI-H460、HCC827的增殖均具有抑制作用,尤其A549細胞,并可誘導(dǎo)A549細胞凋亡和抑制細胞遷移[18]。然而,蒼術(shù)素在EGFR-TKI耐藥NSCLC中的作用尚有待探索。吉非替尼是第一代EGFR-TKI的一線治療藥物[19],本研究通過低濃度逐步加量誘導(dǎo)法構(gòu)建EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR,結(jié)果顯示H1975/GR細胞對吉非替尼的IC50顯著高于H1975細胞對吉非替尼的IC50,表明本研究所構(gòu)建的EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR可以用于后續(xù)實驗。此外,本研究發(fā)現(xiàn)(20、40、60 μmol/L)蒼術(shù)素均可顯著降低H1975、H1975/GR細胞存活率,但對BEAS-2B細胞存活率無顯著影響,故選用20、40、60 μmol/L蒼術(shù)素作為低、中、高濃度進行下一步實驗。進一步分析顯示,低、中、高濃度蒼術(shù)素均可降低H1975/GR細胞增殖活力,且呈濃度依賴性。表明蒼術(shù)素可抑制EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR增殖。此外,靶向調(diào)節(jié)細胞周期,從而誘導(dǎo)細胞周期阻滯是抑制腫瘤細胞增殖的主要特征之一,也是一種重要的抗腫瘤機制[20]。本研究結(jié)果顯示,蒼術(shù)素可呈濃度依賴性降低H1975/GR細胞中G0/G1細胞比例,并升高G2/M細胞比例。提示蒼術(shù)素可能通過誘導(dǎo)EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR G2/M期阻滯,進而抑制細胞增殖。細胞凋亡亦可影響細胞生長、分化等生理過程,與癌癥等病理過程密切相關(guān),且近三十多年來,臨床腫瘤學(xué)的支柱和目標(biāo)一直是開發(fā)通過促進細胞凋亡而有效消除癌細胞的療法[21]。本研究中,蒼術(shù)素可呈濃度依賴性升高H1975/GR細胞凋亡率,表明蒼術(shù)素可能是通過促進EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR凋亡而殺死癌細胞的潛在藥物。

Notch信號通路是一條進化上十分保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,Notch受體(包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)通過與配體相互作用激活Hes、HEY等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因,從而轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞信號調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程,且Notch信號通路的異常激活與肝癌[22]、肺癌[23]等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,Notch信號通路與肺腺癌化療耐藥有關(guān),且Notch1可促進NSCLC細胞的吉非替尼耐藥[24]。Notch3在肺腺癌組織和EGFR-TKI耐藥細胞系(HCC827/GR6)中表達上調(diào),且Notch3蛋白高表達的患者與較短的總生存期相關(guān)[25]。本研究結(jié)果顯示,蒼術(shù)素可呈濃度依賴性降低H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA和蛋白表達水平,表明蒼術(shù)素可能通過抑制Notch信號通路激活調(diào)控EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR增殖、細胞周期和凋亡。為了進一步驗證Notch信號通路的作用,本研究使用Notch抑制劑干預(yù)H1975/GR細胞,結(jié)果顯示Notch抑制劑既可抑制Notch信號通路激活,又能夠降低H1975/GR細胞增殖活力和G0/G1細胞比例,并升高G2/M細胞比例和凋亡率,且其作用效果與高濃度蒼術(shù)素幾乎相當(dāng)。這進一步表明Notch信號通路可能參與蒼術(shù)素調(diào)控EGFR-TKI耐藥細胞增殖、細胞周期和凋亡的過程。

綜上所述,蒼術(shù)素可抑制EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞株H1975增殖,并誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡,其作用機制可能與抑制Notch信號通路激活有關(guān)。本研究為蒼術(shù)素在EGFR-TKI耐藥NSCLC治療中的應(yīng)用提供了一定實驗依據(jù)。