產前地塞米松暴露對雄性子代大鼠生殖功能的影響

張園園 裴林國

地塞米松為合成類糖皮質激素，由于其能夠促進胎兒肺的成熟、減少新生兒呼吸窘迫綜合征的發生、降低圍產兒死亡率被廣泛用于早產相關妊娠疾病[1]。然而，產前地塞米松暴露對子代而言可能是把雙刃劍，大量研究發現，它對孕婦和胎兒發育有明顯的不利影響，潛在的后遺癥包括骨關節炎、高血壓、脂肪肝、腎小球硬化、抑郁癥、糖尿病和不孕等[2]。本文建立孕期地塞米松暴露的大鼠模型，探討其雄性子代成年期睪丸的睪酮合成功能及生精功能的變化；以期為闡述機制提供理論依據，為解析其對宮內環境的干擾以及子代后天生殖系統發育產生的影響提供理論和實驗基礎，為臨床應用地塞米松治療產前關疾病治療策略的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

地塞米松磷酸鈉注射液（鄭州卓峰制藥，1 mL：2 mg）；大鼠睪酮ELISA試劑盒（bio-techne公司，美國）大鼠黃體生成素（luteinizing hormone，LH）ELISA試劑盒（江蘇萊爾生物）；3β-羥基固醇脫氫酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-hsd）抗體（英國abcam公司）；二抗來自武漢埃博泰克公司。逆轉錄PCR試劑購于大連寶生物公司。

1.2 處理動物及收集標本

SD大鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號為110322210100778134，許可證號為SCXK（京）2019-0008。大鼠適應性喂養7 d后，于每天6：00pm以雌雄2：1進行合籠，第2天上午8：00以陰道分泌物涂玻片，顯微鏡下見到精子者記為孕0 d。受孕大鼠以體質量由大到小的序列編號，用隨機數字表隨機選擇一個數字并沿其下方向抄取數字，體質量為偶數的大鼠放入對照組，體質量為奇數的大鼠放入PDE組，兩組分別為30只孕鼠。從懷孕第10天開始稱體重，每天1次，直到孕20 d結束。在孕14～18 d期間，PDE組的懷孕大鼠鼠每天皮下注射地塞米松0.4 mg/kg，對照組則給予0.5 mL生理鹽水皮下注射。懷孕20 d時，隨機選取懷孕大鼠用剖宮產的方式取胎鼠，選取胎鼠數8～10只并且雄性胎鼠大于4只的懷孕大鼠納入實驗（n＝8）。每窩所雄性胎鼠血液合并成1管，分離血清。

其他的懷孕大鼠自然分娩，取符合胎鼠數8～10只并且雄性胎鼠＞4只的懷孕大鼠納入實驗。出生后1周起，每周1次稱量雄性子代鼠的體重，直至第11周（n＝8）。出生后21 d子代鼠斷奶，以后以正常的飲食喂養至出生后90 d。麻醉后斷頸處死大鼠，頸動脈取血并分離血清，冰箱保存；打開腹腔后迅速分離右側睪丸，利用10%的甲醛溶液固定，12 h后用石蠟包埋；其他的睪丸放置于-40℃冰柜中保存備用（動物實驗流程圖見圖1）。

圖1 動物實驗流程

1.3 檢測血清中激素濃度

采用大鼠睪酮的ELISA試劑盒檢測雄性子代鼠血清中的各種激素濃度：一抗在室溫下孵育1 h后，按照說明書加入待測的血清以及標準曲線的工作液，繼續加入睪酮的結合液在室溫下孵育3 h，孵育后加入底物在避光環境下繼續室溫孵育30 min后加入終止液，利用酶標儀分別檢測450 nm和570 nm的吸光度值（A值）來計算樣本值。

1.4 睪丸總RNA提取及PCR實時定量檢測

睪丸組織（每窩取3個胎睪丸合并一個樣，成年睪丸夾取組織30 mg），按RNA提取的說明書進行，并進行cDNA的合成和PCR擴增。然后檢測睪丸組織的甾體合成急性調控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，Star）、P450側鏈裂解酶（P450 side chain cleavage enzyme，Cyp11a1），3β-hsd的表達。以標準品相對濃度作為橫坐標，各自樣本Ct為縱坐標。以2-△△ct計算基因的表達水平。

1.5 睪丸熒光檢測

石蠟切片脫蠟，加羊血清室溫環境下封閉30 min，吸掉封閉液，加一抗4 ℃環境下孵育過夜；利用PBS洗片3次，加熒光二抗（濃度為1：400），在濕盒中37 ℃孵育1 h，淬滅劑封片溶液進行封片。采用日本尼康Eclipse Ci-S直立顯微鏡拍照并進行熒光計數。

1.6 精子數量檢測

在盛有 5 mL Hanks液（保持37 ℃）的培養皿中剪碎附睪尾孵育30 min，進行10倍稀釋，在光學顯微鏡100倍視野下用血細胞計數板計數4個大方格的精子數量，重復計數4次取平均值。每毫升液體中的精子數量＝4個方格中的精子平均數量×稀釋倍數×104。

1.7 統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件分析數據。計量資料以（±s）表示，進行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDE子代雄性大鼠的體重變化

地塞米松產前暴露組雄性子代大鼠的出生體重為（5.41±0.43）g，低于對照組的（6.00±0.25）g，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。這種趨勢一直持續至出生后3周，從出生后第4周開始，地塞米松產前暴露組雄性子代大鼠的體重追趕上對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 地塞米松產前暴露組與對照組PDE子代雄性大鼠的體重變化比較（g，±s）

表1 地塞米松產前暴露組與對照組PDE子代雄性大鼠的體重變化比較（g，±s）

組別出生0周出生1周出生2周出生3周出生4周出生5周對照組（n＝8）6.00±0.2511.82±0.4623.32±1.5735.14±2.8069.70±5.80116.14±9.46地塞米松產前暴露組（n＝8）5.41±0.4310.66±1.0320.57±2.6631.12±3.3163.52±6.80110.04±11.37 t值3.5403.1002.6802.7902.0701.240 P值0.0030.0100.0190.0130.0550.230組別出生6周出生7周出生8周出生9周出生10周出生11周對照組（n＝8）148.89±10.66190.93±16.07241.47±16.46279.62±18.79315.64±24.89342.92±27.86地塞米松產前暴露組（n＝8）141.57±8.27184.49±12.56235.47±17.12273.19±19.65319.61±23.52348.29±21.95 t值1.6300.950 0.7600.710 -0.350-0.450 P值0.1200.3600.4600.4900.7300.660

2.2 PDE子代雄性胎鼠血清的睪酮濃度和睪丸間質細胞的數量

與對照組相比，地塞米松產前暴露組的雄性胎鼠血清睪酮明顯降低（P＜0.05），胎睪丸間質細胞的數量也降低（P＜0.05），見表2。

表2 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠血清睪酮濃度和睪丸組織間質細胞數量（±s）

表2 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠血清睪酮濃度和睪丸組織間質細胞數量（±s）

組別胎血睪酮濃度（n＝8，ng/mL）3β-hsd陽性細胞數（n＝5，×103）對照組1.78±0.96146.72±15.56地塞米松產前暴露組0.99±0.25123.34±7.95 t值2.2522.994 P值＜0.05＜0.05

2.3 PDE子代雄性胎鼠睪丸甾體激素合成酶的基因表達

與對照組相比，地塞米松產前暴露組雄性胎兒大鼠睪丸組織的Star、Cyp11a1、3β-hsd的基因表達水平均降低，見表3。

表3 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠睪丸組織中甾體激素合成酶的基因表達（±s）

表3 孕期地塞米松暴露子代雄性胎鼠睪丸組織中甾體激素合成酶的基因表達（±s）

組別指標表達量t值 P值對照組（n＝8）Star0.68±0.212.453 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）0.36±0.08對照組（n＝8）Cyp11a10.56±0.129.302 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）0.16±0.02對照組（n＝8）3β-hsd1.63±0.354.174 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）0.79±0.45

2.4 PDE子代雄性大鼠的血清睪酮濃度及睪丸間質細胞數量

與對照組相比，地塞米松產前暴露組的雄性成年大鼠的血清睪酮濃度降低（P＜0.01），血清黃體生成素濃度升高（P＜0.05），血清黃體生成素與睪酮的比值升高（P＜0.05）。出生后90 d的雄性大鼠的睪丸間質細胞的數量為（18.53±3.22）個，低于對照組的（42.00±5.49）個，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表4。

表4 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的血清睪酮濃度和睪丸組織間質細胞的數量（±s）

表4 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的血清睪酮濃度和睪丸組織間質細胞的數量（±s）

組別表達量t值 P值對照組（n＝8）成年雄性大鼠血睪酮濃度（g/mL）3.56±0.2510.586 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）1.98±0.34對照組（n＝8）成年雄性大鼠血黃體生成素濃度（ng/mL）2.78±0.2611.445 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）4.48±0.33對照組（n＝8）黃體生成素：睪酮0.82±0.246.552＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）2.23±0.56對照組（n＝5）3β-hsd+細胞數量（×106）42.00±5.498.251 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝5）18.53±3.22

2.5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睪丸甾體激素合成酶的基因表達

與對照組相比，地塞米松產前暴露組雄性成年大鼠睪丸Star和3β-hsd的基因表達水平降低（P＜0.05），Cyp11a1的表達水平無變化，見表5。

表5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睪丸組織甾體激素合成酶的基因表達（±s）

表5 孕期地塞米松暴露子代雄性大鼠的睪丸組織甾體激素合成酶的基因表達（±s）

組別指標表達量t值 P值對照組（n＝8）Star6.48±0.2638.592 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）1.92±0.21對照組（n＝8）Cyp11a18.98±0.232.045 2 ＞0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）8.14±0.36對照組（n＝8）3β-hsd10.25±2.244.851 ＜0.05地塞米松產前暴露組（n＝8）5.19±1.92

2.6 PDE子代雄性大鼠的附睪精子參數

結果研究表明，與對照組相比，地塞米松產前地塞米松產前暴露組雄性成年大鼠附睪尾部精子數量為（24.21±8.79）個，低于對照組的（79.24±15.23）個，差異有統計學意義（t＝6.998，P＜0.01）。

3 討論

據統計，全球的早產兒出生率占總新生兒出生率的5%，而早產仍然是新生兒死亡的主要原因[3]。目前，糖皮質激素依然是改善早產兒結局的最重要的治療手段之一，針對孕24～34周并有早產風險的婦女，臨床建議使用糖皮質激素治療[4]。有研究發現，在大鼠中，產前接觸合成類固醇地塞米松（很容易穿過胎盤）或抑制Ⅱ型11β-羥基類固醇脫氫酶的物質，出生體質量會降低[5-7]。本研究也發現，地塞米松產前暴露組雄性子代大鼠的出生體質量低于對照組，這種趨勢一直持續至出生后3周，從出生后第4周開始雄性子代大鼠的體質量追趕上對照組。

睪酮是促進胎兒包括生殖器的發育、睪丸下降等器官向雄性方向發育的主要激素[8]。研究發現，睪丸間質細胞是分泌睪酮的主要細胞，大鼠在胎兒期時體內的睪酮主要由胎睪丸間質細胞在系列甾體合成酶催化下產生的，而睪丸間質細胞的分布以及數量變化能夠影響睪酮的產量[9-10]。本文發現，地塞米松產前暴露組的胎鼠血清中睪酮濃度降低，同時胎睪丸間質細胞的數量降低并伴隨甾體合成酶Star和3β-hsd表達水平的降低。以上結果顯示，宮內時期，產前地塞米松暴露的子代大鼠血中睪酮濃度下降與睪丸間質細胞數量降低和甾體合成酶Star和3β-hsd的基因表達降低有關。

研究發現，宮內時期發育階段雄激素水平缺乏能夠導致成年后生殖系統疾病發生風險性增加[11]，并且雄激素能夠促進精子的發生和發育[12]。在成年時期，睪丸間質細胞睪酮合成的過程主要是由下丘腦-垂體軸分泌的黃體生成素調節有關。本研究中發現，產前地塞米松暴露的90 d子代雄性大鼠出現了血睪酮濃度的下降，但是血中黃體生成素的濃度卻反饋性的升高；此外，睪丸間質細胞數量減少、甾體合成酶Star和3β-hsd的表達水平下降90 d子代大鼠的附睪精子數量減少。因此，產前地塞米松暴露的成年后子代大鼠精子數量減少可能與血中睪酮濃度降低相關。

研究表明，Star參與了類固醇激素的原料膽固醇由線粒體外膜向內膜的轉運，它是睪酮合成過程中的重要限速步驟[13-14]。本文發現，甾體合成酶Star和3β-hsd的基因表達在宮內和出生后成年期的大鼠出現了一致性的表達降低，而3β-hsd不被認為是睪酮合成的限速步驟[15-16]。因此，產前地塞米松暴露所致的Star的表達降低可能是子代大鼠睪酮水平持續降低的主要機制之一。

綜上所述，產前地塞米松暴露能夠導致子代大鼠在宮內出現血清睪酮濃度降低，并能夠延續到出生后成年期，同時還伴隨精子數量減少，這種現象的發生可能與宮內產前地塞米松暴露所致的甾體酶Star的基因表達降低有關。