火箭發(fā)射前后文昌兩種熱帶森林類型土壤微生物多樣性變化

王小燕，薛超文，吳師強(qiáng)，宿少鋒，林之盼，雷湘齡

1.海南省林業(yè)科學(xué)研究院(海南省紅樹林研究院)，海南 海口 571100；

2.海南大學(xué)，海南 ?？?570228

航天活動(dòng)與其它人為的工業(yè)生產(chǎn)一樣給生態(tài)環(huán)境帶來潛在的威脅。自20 世紀(jì)50 年代以來，向太空發(fā)射火箭的國(guó)家逐漸增多，而火箭升空瞬間產(chǎn)生的反作用力，干擾了地球公轉(zhuǎn)的軌道，使地球漸漸靠近太陽公轉(zhuǎn)，太陽照射到地球的光越來越強(qiáng)烈，由此成為了全球變暖的重要影響因素之一。而在全球變暖的影響下，生物多樣性也受到了影響。有研究發(fā)現(xiàn)，酸性污染物來源于沖刷用水。航天飛機(jī)發(fā)射時(shí)助推火箭噴出的高速氣流會(huì)產(chǎn)生震耳欲聾的噪音和振動(dòng)，為了減少噪聲和振動(dòng)就需要用水來沖刷反射坑，助推火箭排氣時(shí)的高熱量將這些高度酸性的水的一部分蒸發(fā)為汽，這些酸性水蒸氣和大量的微粒散落到土壤中改變土壤微生物的生存環(huán)境。同時(shí)，也有研究表明中國(guó)運(yùn)載火箭使用的推進(jìn)劑N2O4與UDMH 在火箭發(fā)射過程中會(huì)產(chǎn)生有毒氣體，而散布在地面的未燃有毒推進(jìn)劑會(huì)蒸發(fā)形成對(duì)環(huán)境污染的各種有毒氣體，從而影響到發(fā)射場(chǎng)周圍的土壤微生物的多樣性等。

在人類社會(huì)不斷發(fā)展的進(jìn)程中，生物多樣性是其賴以生存的根基，人類作為地球生命共同體的一部分，通過與生態(tài)系統(tǒng)的信息交換、物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)等過程，參與了生物多樣性的持續(xù)發(fā)展[1]。土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中數(shù)量多，生物多樣性復(fù)雜，參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解、養(yǎng)分的遷移轉(zhuǎn)化、腐殖質(zhì)的合成，推動(dòng)土壤的發(fā)育和形成?；鸺邳c(diǎn)火時(shí)噴射時(shí)產(chǎn)生大量的火光和煙塵，并伴隨著噪音和震動(dòng)[2-3]，可能對(duì)周邊森林土壤微生物造成擾動(dòng)。已有研究表明火箭的發(fā)射會(huì)對(duì)航天發(fā)射場(chǎng)周圍植被多樣性產(chǎn)生影響[4-6]，但由于火箭發(fā)射并不常見，因此少見關(guān)于火箭發(fā)射對(duì)土壤微生物多樣性變化的研究報(bào)道。

該研究以2016 年6 月25 日、2017 年4 月20日、2017 年7 月2 日3 次火箭發(fā)射前后開展土壤微生物采樣調(diào)查，分析火箭發(fā)射前后在椰子純林和混交林中土壤微生物豐富度、多度的差異，探討火箭發(fā)射對(duì)兩種森林類型中土壤微生物可能帶來的變化，為研究火箭發(fā)射對(duì)不同熱帶森林類型土壤微生物的變化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

研究區(qū)位于文昌衛(wèi)星發(fā)射場(chǎng)周邊的兩種森林類型，即混交林(地理坐標(biāo)：19°43′58″N，110°57′34″E)和椰子純林（地理坐標(biāo)：19°34′58″N，110°51′15″E）。其中，混交林主要由11 種樹種組成，分別為潺槁木姜子（Litsea glutinosa）、椰子（Cocos nucifera）、瓊崖海棠(Calophyllum inophyllum)、木麻黃（Casuarina equisetifolia）、柳葉密花樹（Rapanea neriifolia）、桃金娘（Rhodomyrtustomentosa）、九節(jié)木（Psychotria rubra）、大青（Clerodendrum cyrtophyllum）、簕欓花椒（Zanthoxylum avicennae）、 了哥王（Wikstroemia indica）和東風(fēng)桔（Atalantia buxifolia）；椰子純林主要由椰子樹種組成，兩種林分已有30 年的種植時(shí)間。研究區(qū)屬熱帶北緣沿海地帶，具有熱帶和亞熱帶氣候特點(diǎn)，屬熱帶季風(fēng)島嶼型氣候。氣溫為22℃～27℃，全年光照時(shí)長(zhǎng)1750h～2650h。 研究區(qū)雨量豐富，年均降雨量達(dá)到1721.6mm，降雨時(shí)空分布不均勻，有明顯的干、濕兩季，雨季主要集中于5 月～10 月。研究區(qū)位于文昌航天發(fā)射場(chǎng)的距離約5km。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集和處理

該研究對(duì)兩種熱帶森林類型土壤微生物共進(jìn)行了6 次采樣，于2016 年6 月25 日、2017 年4 月20日、2017 年7 月2 日進(jìn)行樣品采集，分別為火箭發(fā)射前后，發(fā)射前采集均在火箭發(fā)射前5d 內(nèi)完成調(diào)查，發(fā)射后采集均在火箭發(fā)射后3d 內(nèi)完成。在每種森林類型樣地內(nèi)設(shè)定3 塊樣方，樣方面積40m2，在每個(gè)樣方內(nèi)按“S”形采集表層土壤（0～20cm），采樣時(shí)去除表層枯落物和浮土，同一樣方點(diǎn)各取100g 土樣，充分混合并去除根系、石塊，裝入無菌密封袋后，放置于4℃的恒溫箱中，帶回試驗(yàn)室內(nèi)放入0℃冰柜中保存，在48h 內(nèi)完成土壤微生物測(cè)定。

稱取10g 土樣，倒入90mL 含少量玻璃珠的無菌水中，采用120r·min-1振動(dòng)床，振蕩30min 后靜置，獲得土壤懸濁液備用。

1.2.2 土壤三大類可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)

①土壤含水量：稱取5g 土樣以105℃烘8h，冷卻后稱干重計(jì)算土壤含水量。

②平板計(jì)數(shù)法：取1mL 土壤懸濁液加入到9mL無菌水中進(jìn)行稀釋，重復(fù)稀釋到10-5稀釋度。取0.5mL 相應(yīng)稀釋度的稀釋液加入到無菌平皿中，倒入冷卻到45℃左右的培養(yǎng)基15mL～20mL，充分混勻后待培養(yǎng)基凝固，倒置平皿放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（見表1），每種微生物取3 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度重復(fù)3 個(gè)平行，培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)。

表1 三大類可培養(yǎng)微生物檢測(cè)條件Tab1. Three Major Categories Can Cultivate Microbial Testing Conditions

③數(shù)據(jù)分析：根據(jù)土壤含水量計(jì)算得到每克土樣中所含的微生物數(shù)量，使用SPSS 19.0 進(jìn)行配對(duì)樣品t 檢驗(yàn)（同一樣地前后兩次檢測(cè)結(jié)果的顯著性分析）。

1.2.3 土壤微生物功能多樣性檢測(cè)

（1）Biolog-ECO 實(shí)驗(yàn)

取5mL 土壤懸濁液，用45mL 無菌水進(jìn)行2 次稀釋，得到1:100 的樣品提取液。利用八通道移液器吸取150μL 提取液加入Biolog-ECO 96 微孔板（Biolog，Hayward，USA）中，在28℃恒溫箱中連續(xù)避光培養(yǎng)240h，每間隔24h 用酶標(biāo)儀（Hayward，USA）讀取590nm 和750nm 的吸光值，并記錄。

（2）數(shù)據(jù)分析

Biolog-ECO 96 微孔板共包括3 組重復(fù)單元，每組單元32 個(gè)孔，由微生物利用的6 大類31 種碳源及1 個(gè)空白對(duì)照孔。其中31 種碳源包括10 種糖類、6 種氨基酸、7 種羧酸、4 種聚合物、2 種胺類、2種酚類（表2）。

表2 ECO 板六類碳源分類Tab.2 ECO Board Six Types of Carbon Source Classification

土壤微生物群落對(duì)碳源利用率用平均每孔顏色變化率表示（AWCD），表征微生物對(duì)各類碳源利用能力的強(qiáng)弱，公式為：AWCD=∑（C-R）/n，式中C為每孔碳源的吸光值；R為對(duì)照孔吸光值；n為碳源數(shù)，即31。

選取包括多維空間距離多樣性McIntosh 指數(shù)（U 值）、菌種優(yōu)勢(shì)度Simpson 指數(shù)（D 值）、物種豐富度Shananon-Wiener 指數(shù)（H’值）和菌種均一性Pielou 均勻度指數(shù)（E 值）4 個(gè)土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤三大類可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)調(diào)查

根據(jù)火箭發(fā)射前后采樣的土壤可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)調(diào)查顯示：火箭發(fā)射前，椰子純林中的微生物總數(shù)為387.52×104cfu/g，其中，細(xì)菌為352.62×104cfu/g、真菌為20.88×104cfu/g、放線菌為14.02×104cfu/g；混交林中微生物總數(shù)為235.10×104cfu/g，其中，細(xì)菌為207.68×104cfu/g、真菌為18.90×104cfu/g、放線菌為8.52×104cfu/g。火箭發(fā)射后，椰子純林中微生物總數(shù)為531.89×104cfu/g，其中，細(xì)菌為318.90×104cfu/g、真菌為60.03×104cfu/g、放線菌為152.96×104cfu/g；混交林中微生物總數(shù)為370.15×104cfu/g，其中，細(xì)菌為190.50×104cfu/g、真菌為47.55×104cfu/g、放線菌為132.10×104cfu/g。對(duì)比火箭發(fā)射前后，混交林土壤微生物總數(shù)增加了135.05×104cfu/g，其中，細(xì)菌減少了17.18×104cfu/g，真菌和放線菌分別增加了28.65×104cfu/g 和123.58×104cfu/g；椰子純林土壤微生物總數(shù)增加了144.37×104cfu/g，其中，細(xì)菌減少33.72×104cfu/g，真菌和放線菌分別增加了138.94×104cfu/g 和147.37×104cfu/g。

分析結(jié)果表明，與發(fā)射前相比，火箭發(fā)射后椰子純林和混交林種土壤微生物總數(shù)均表現(xiàn)為明顯升高趨勢(shì)（P＜0.05，表3）。但三大類微生物又表現(xiàn)出不同的結(jié)果，其中真菌和放線菌總數(shù)發(fā)射后比發(fā)射前呈現(xiàn)極顯著增加（P＜0.01），而細(xì)菌數(shù)量發(fā)射后比發(fā)射前呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但差異性不顯著。

表3 火箭發(fā)射前后椰子純林和混交林土壤可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)Tab.3 Counts of Culturable Microorganisms in Soil of Coconut Pure Forest and Mixed Forest Before and After Rocket Launch

2.2 土壤微生物功能多樣性特征

2.2.1 土壤微生物總碳源利用的動(dòng)力學(xué)分析

從土壤微生物總碳原利用整體情況（AWCD 值，圖1、圖2）來看，椰子純林和混交林在火箭發(fā)射前后均呈現(xiàn)出略微的增加。結(jié)果表明，與發(fā)射前相比，火箭發(fā)射后，土壤微生物利用碳源的能力有所提升，可能是由于火箭發(fā)射沉降物促進(jìn)了土壤微生物的生理活性，使得土壤微生物活性增加，利用碳源的能力也有所增加。

圖1 火箭發(fā)射前后椰子純林的平均吸光值（AWCD）的差異Fig.1 The Absorbance Value (AWCD) of Coconut Pure Forest Before and After Rocket Launch

圖2 火箭發(fā)射前后椰子純林的平均吸光值（AWCD）的差異Fig.2 The Absorbance Value (AWCD) of Mixed Forest Before and After Rocket Launch

2.2.2 土壤微生物對(duì)不同碳源利用特征分析

根據(jù)化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)，（ECO 板上，圖3、圖4）來看，可以將ECO 板上的31 種碳源分為六大類，即胺類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、碳水化合物類、酚酸類。選取拐點(diǎn)時(shí)間（72h）培養(yǎng)時(shí)間的吸光值，對(duì)兩種群落土壤微生物六類碳源的利用率進(jìn)行分析。

圖3 火箭發(fā)射前后椰子純林的六大類碳源利用的差異Fig.3 Differences in the Utilization of Six Types of Carbon Sources Pure Coconut Forests Before and After the Launch of The Rocket

圖4 火箭發(fā)射前后混交林六大類碳源利用的差異Fig.4 Differences in the Utilization of Six Types of Carbon Sources Mixed Forests Before and After the Launch of the Rocket

椰子純林和混交林土壤微生物六大類碳源的利用率相似，均為利用多聚物類、氨基酸類的能力較高，利用胺類、酚酸類能力較弱。與發(fā)射前相比，火箭發(fā)射后兩種林分土壤微生物對(duì)六大類碳源的利用率均有不同程度的增加，尤其對(duì)酚酸類碳源的利用率顯著增加。

2.2.3 土壤微生物多樣性指數(shù)特征

選取72h 的AWCD 吸光值對(duì)微生物多樣性指數(shù)進(jìn)行分析（表4）。由表4 可知，混交林McIntosh index（U）指數(shù)高于椰子純林，而Shannon 指數(shù)（H'）、Simpson 指數(shù)（D）和Pielou 指數(shù)（E）3 種指數(shù)兩種林分幾乎一致。與發(fā)射前相比，火箭發(fā)射后混交林McIntosh index（U）指數(shù)呈顯著性增加，而混交林McIntosh index（U）呈顯著性降低。椰子林發(fā)射前后Shannon 指數(shù)（H'）、Simpson 指數(shù)（D）和Pielou 指數(shù)（E）3 種指數(shù)均無差異。而混交林種Shannon 指數(shù)（H'）、Simpson 指數(shù)（D）和Pielou 指數(shù)（E）3 種指數(shù)均有不同程度降低。

表4 火箭發(fā)射前后椰子純林和混交林微生物多樣性指數(shù)特征Tab.4 Characteristics of Microbial Diversity Index of Coconut Pure Forest and Mixed Forest Before and After Rocket Launch

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

（1）火箭發(fā)射前椰子純林土壤微生物總數(shù)達(dá)到387.52×104cfu/g，其中，細(xì)菌為352.62×104cfu/g、真菌為20.88×104cfu/g、放線菌為14.02×104cfu/g；混交林土壤微生物總數(shù)為235.10×104cfu/g，其中，細(xì)菌為207.68×104cfu/g、真菌為18.90×104cfu/g、放線菌為8.52×104cfu/g。椰子純林微生物總數(shù)顯著大于混交林。

（2）與發(fā)射前相比，火箭發(fā)射后椰子純林和混交林種土壤微生物總數(shù)均表現(xiàn)為明顯升高趨勢(shì)。

3.2 討論

（1）影響土壤微生物群落多樣性的因素很多，其中林分類型是最重要的因素之一。研究結(jié)果表明，兩種林分類型土壤微生物代謝功能多樣性指標(biāo)（AWCD）大小為：混交林＞椰子純林?？梢?，在立地條件一致的情況下，不同的林分結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能亦不相同。以往研究表明天然林土壤微生物功能多樣性更優(yōu)于人工林[7]，混交林土壤微生物功能多樣性優(yōu)于純林[8]，這可能是因?yàn)榛旖涣帜軌蛟黾又脖晃锓N豐富度，其根系分泌物種類越多，使得根系附近土壤微生物群落增加，同時(shí)林下凋落物也會(huì)覆積，致使土層腐殖質(zhì)增加，改善了土壤養(yǎng)分，促進(jìn)土壤碳氮磷的循環(huán)，為微生物的繁殖和生長(zhǎng)提供較高的動(dòng)力[9]。

（2）兩種植被類型土壤微生物對(duì)六大類碳源底物利用率均存在顯著性差異（P＜0.05）。說明不同的地上植被，其根系或根系分泌物影響著土壤微生物群落對(duì)碳源的利用程度。研究表明，不同碳源在根系土壤中的有效性不同，碳源有效性越長(zhǎng)，越有利于利用此類碳源微生物的生長(zhǎng)[10]。

（3）森林生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物群落多樣性還受土壤養(yǎng)分、凋落物類型、根系分泌物、周邊環(huán)境條件的影響[11-12]。研究表明，森林生態(tài)系統(tǒng)中，林分類型與其林下土壤微生物相輔相成，不同林分類型通過改變凋落物的數(shù)量和組成影響土壤養(yǎng)分特征，進(jìn)而制約土壤微生物的數(shù)量、組成和分布差異[13]。

研究發(fā)現(xiàn)火箭發(fā)射對(duì)文昌衛(wèi)星發(fā)射場(chǎng)周邊的熱帶人工林土壤微生物多樣性具有一定變化，微生物總數(shù)均呈現(xiàn)顯著增加。但此次的研究也存在一定的局限性。微生物多樣性還受環(huán)境因素（如降雨、強(qiáng)風(fēng)等）影響產(chǎn)生變化，由于發(fā)射前和發(fā)射后可能環(huán)境因素存在偏差，還需要長(zhǎng)期持續(xù)的開展監(jiān)測(cè)研究。此外，該研究中僅對(duì)可培養(yǎng)微生物進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，后續(xù)可結(jié)合微生物測(cè)序，更加精準(zhǔn)全面的研究火箭發(fā)射對(duì)土壤微生物多樣性的研究。