骨髓間充質干細胞外泌體源性miR-214-3p調控IKBKB基因促進宮頸癌細胞焦亡

黎康玲，張瀟迪，劉玨，張志偉

骨髓間充質干細胞外泌體源性miR-214-3p調控IKBKB基因促進宮頸癌細胞焦亡

黎康玲1，張瀟迪1，劉玨1，張志偉2

1.南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院婦產科，湖南衡陽 421000；2.南華大學腫瘤細胞與分子病理學湖南省重點實驗室，湖南衡陽 421000

探究骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）外泌體源性miR-214-3p調控B細胞κ輕肽基因增強子抑制因子激酶β（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta，IKBKB）對宮頸癌細胞的影響。采用生物信息學方法分析宮頸癌組織中異常表達的微RNA，最終選擇miR-214-3p作為目的基因，并確定其下游靶基因IKBKB；檢測宮頸癌患者的癌組織及癌旁組織中miR-214-3p、IKBKB的表達情況；提取并鑒定BMMSC外泌體，干預外泌體中miR-214-3p的表達水平，構建IKBKB過表達質粒，將改造后的外泌體及質粒分別轉染至宮頸癌HeLa細胞，測定轉染后不同組別宮頸癌細胞焦亡相關指標。生物信息學和實驗檢測均發現miR-214-3p在宮頸癌組織和細胞中低表達，而在BMMSC外泌體中高表達，且BMMSC源性外泌體可顯著提高宮頸癌細胞中miR-214-3p的表達水平；IKBKB基因是miR-214-3p的下游靶點，在宮頸癌組織和細胞中高表達；高表達miR-214-3p可促進宮頸癌細胞焦亡，過表達IKBKB基因后宮頸癌細胞的焦亡水平顯著降低。BMMSC分泌的外泌體通過攜帶miR-214-3p調控IKBKB促進宮頸癌細胞焦亡。

骨髓間充質干細胞；外泌體；miR-214-3p；IKBKB；宮頸癌

宮頸癌是女性癌癥死亡的主要原因，近年來發病逐漸年輕化[1-2]。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗及宮頸細胞學早期篩查的推廣，使宮頸癌在預防與早期發現方面取得巨大進展[3]。然而仍有部分患者因復發與淋巴結轉移導致死亡[4]。分子生物學的發展對探究宮頸癌的發病機制具有重要意義[5]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）是一種多能干細胞，可轉移至腫瘤組織內進而影響腫瘤進展[6]。外泌體是指包含多種RNA等生物分子的小膜泡[7]。它被證實可能參與細胞生長分化和腫瘤轉移等多種病理生理過程[8]。Huang等[9]研究發現間充質干細胞來源的外泌體可改善原發性卵巢功能不全患者的卵巢功能。miR-214富集BMMSC衍生的外泌體通過靶向Ca2+/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ調節心臟干細胞的氧化損傷[10]。但目前BMMSC外泌體源性miR-214-3p對宮頸癌的具體作用尚未闡明。本研究旨在深入探討BMMSC外泌體源性miR-214-3p對宮頸癌發生發展的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年11月至2020年11月于南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院接受手術治療的宮頸癌患者45例，年齡（46.9±12.8）歲。患者均經病理診斷確診為宮頸癌且術前未接受放化療或其他全身性治療，并除外其他系統的惡性腫瘤或合并嚴重的全身性疾病。本研究經南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院倫理委員會批準（倫理審批號：2019k007）。

1.2 細胞及試劑

正常宮頸上皮細胞株HaCaT購自上海艾研生物科技有限公司，宮頸癌細胞株HeLa及BMMSC購自廣州賽庫生物技術有限公司，Lipofectamine 3000試劑盒、Exo-FectTM外泌體轉染試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，雙熒光素酶基因檢測試劑盒購自GeneCopoeia公司，熒光素酶報告質粒psiCHECK-2購自美國Promega公司。

1.3 生物信息學分析

在GEO數據庫中選擇GSE55478數據集進行分析，該數據集包括4例宮頸癌組織及對應的正常子宮頸組織中差異表達的微RNA（microRNA，miRNA）。繪制火山圖并選擇在宮頸癌中顯著下調的前10個miRNA繪制熱圖。DIANA TOOLS網站對miRNA進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。在TargetScan網站獲取miR-214-3p的下游靶基因并借助DAVID網站進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析。DisGeNET網站檢索宮頸癌發病風險基因。STRING數據庫進行蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析。UALCAN網站分析B細胞κ輕肽基因增強子抑制因子激酶β（inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta，IKBKB）的表達水平。

1.4 細胞培養

將正常宮頸上皮細胞株HaCaT與宮頸癌細胞株HeLa在杜爾貝克改良的Eagle’s培養基中培養。待細胞融合度達到80%左右進行后續實驗。使用定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術檢測HaCaT與HeLa細胞株中miR-214-3p、IKBKB的表達。

1.5 靶向關系驗證

TargetScan網站預測miR-214-3p與IKBKB特異性結合位點，將IKBKB中含有miR-214-3p結合位點的3’UTR片段擴增并克隆到熒光素酶報告質粒psiCHECK-2，將該質粒命名為IKBKB-WT。在原有結合位點進行定點突變，形成突變片段，同樣擴增并克隆到psiCHECK-2質粒上，將該質粒命名為IKBKB-MUT。將以上兩種質粒分別與miR-214-3p NC、miR-214-3p mimic共轉染至宮頸癌細胞株HeLa中，轉染步驟依據Lipofectamine 3000轉染試劑說明書進行，最后借助雙熒光素酶基因檢測試劑盒對兩組細胞的熒光素酶活性進行檢測，并使用海腎熒光素酶活性對結果進行歸一處理。

1.6 提取BMMSC及BMMSC源性外泌體

將BMMSC接種于杜爾貝克改良的Eagle’s培養基中，37℃、5% CO2環境中培養。每3天更換一次培養基，選擇第5代細胞進行后續實驗。通過流式細胞術鑒定BMMSC，再將BMMSC在超速離心后不含外泌體的杜爾貝克改良Eagle’s培養基中培養48h，收集上清液。之后采用差速離心法分離外泌體。4℃下300g離心10min，2000g離心15min，清除細胞碎片，4℃下100 000g離心1h。將沉淀重懸在磷酸鹽緩沖液中，4℃下100 000g離心90min，收集沉淀–80℃保存。通過蛋白質印跡法檢測外泌體表面標記蛋白CD63、CD9、CD81的表達。

1.7 細胞內化實驗

BMMSC在PKH67染色液中懸浮，室溫孵育4min。加入0.5%牛血清白蛋白使反應終止。分離BMMSC外泌體，得到PKH67標記的外泌體。將外泌體懸浮并與HeLa細胞在37℃、5% CO2培養箱中共孵育3h。加入DAPI將細胞核染色。在熒光顯微鏡下觀察染色的HeLa細胞。

1.8 細胞轉染和分組

本研究分組如下：control組（未經處理的HeLa細胞）、exo組（外泌體與HeLa細胞共培養）、exo-miR-214-3p組（轉染miR-214-3p mimic的外泌體與HeLa細胞共培養）、exo-inh-miR-214-3p組（轉染miR-214-3p inhibitor的外泌體與HeLa細胞共培養）、exo-miR-214-3p+pcDNA3.1組（轉染miR-214-3p mimic的外泌體與轉染pcDNA3.1對照的HeLa細胞共培養）、exo-miR-214-3p+pcDNA3.1-IKBKB組（轉染miR-214-3p mimic的外泌體與轉染過表達IKBKB的HeLa細胞共培養）。依據Lipofectamine 3000試劑盒與Exo-FectTM外泌體轉染試劑盒進行轉染，48h后進行后續實驗。

1.9 細胞焦亡檢測

檢測轉染后各組別中核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、胱天蛋白酶-1（caspase-1）、銜接蛋白、消皮素D mRNA的表達水平。將轉染后的細胞在37℃、5% CO2的條件下培養，1500轉/min離心10min，收集上清液進行酶聯免疫吸附測定，檢測白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-18分泌水平。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 miR-214-3p在宮頸癌組織中低表達

GSE55478數據集中38個miRNA在宮頸癌中顯著上調，53個miRNA顯著下調，見圖1A。選擇在宮頸癌中顯著下調的前10個miRNA繪制出熱圖，見圖1B。qRT-PCR檢測結果顯示，宮頸癌組織中miR-214-3p相對表達顯著低于癌旁組織（<0.05），見圖1C。BMMSC源性外泌體中miR-214-3p的表達上調（<0.05），見圖1D。將PKH67標記的外泌體與HeLa細胞共孵育，外泌體顯著提高HeLa細胞中miR-214-3p的表達（<0.05），見圖1E。

圖1 miR-214-3p在宮頸癌組織中的表達結果

A.GSE55478數據集火山圖；B.GSE55478數據集中顯著下調的前10個miRNA的熱圖；C.宮頸癌患者癌組織和癌旁組織中miR-214-3p的表達比較；D.miR-214-3p在外泌體及HeLa細胞中的表達差異；E.外泌體與HeLa細胞共孵育后miR-214-3p的表達檢測結果

注：<0.05

2.2 miR-214-3p與IKBKB靶向關系驗證

借助TargetScan網站檢索與miR-214-3p存在特異性結合位點的基因進行GO功能富集分析并繪制氣泡圖，見圖2A。PPI分析結果顯示IKBKB與環氧合酶2（PTGS2）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、周期蛋白依賴激酶抑制因子2A（CDKN2A）等蛋白具有較強的聯系，見圖2B。雙熒光素酶報告實驗進一步確定miR-214-3p與IKBKB的靶向關系，見圖2C。UALCAN網站顯示IKBKB在宮頸癌中表達上調，見圖2D。qRT-PCR進行驗證，癌組織中的IKBKB呈現高表達（<0.05），見圖2E。宮頸癌組織中IKBKB的表達與miR-214-3p呈負相關（<0.05），見圖2F。

2.3 BMMSC及BMMSC源性外泌體鑒定結果

蛋白質印跡法檢測外泌體標記物CD63、CD9、CD81均呈陽性表達，見圖3。

2.4 miR-214-3p調控IKBKB基因促進宮頸癌細胞焦亡

2.4.1 轉染后各組細胞的NLRP3、caspase-1、銜接蛋白、消皮素D mRNA表達水平比較 與control組比較，exo-inh-miR-214-3p組的NLRP3、caspase-1、銜接蛋白、消皮素D mRNA表達水平無明顯變化（0.05），exo組和exo-miR-214-3p組的NLRP3、caspase-1、銜接蛋白、消皮素D mRNA表達水平顯著升高（<0.05）；exo-miR-214-3p+pcDNA3.1-IKBKB組的NLRP3、caspase-1、銜接蛋白、消皮素D mRNA表達水平顯著低于exo-miR-214-3p+pcDNA3.1組（<0.05），見圖4。

2.4.2 轉染后各組細胞的IL-1β、IL-6、IL-18比較 與control組比較，exo-inh-miR-214-3p組的IL-1β、IL-6、IL-18無明顯變化（>0.05），exo組和exo-miR-214-3p組的IL-1β、IL-6、IL-18顯著升高（<0.05）；exo-miR-214-3p+pcDNA3.1-IKBKB組的IL-1β、IL-6、IL-18顯著低于exo-miR-214-3p+ pcDNA3.1組（<0.05），見圖5。

圖2 IKBKB與miR-214-3p靶向關系驗證及其表達水平測定

A.miR-214-3p靶基因的GO分析結果；B.PPI分析結果；C.雙熒光素酶報告實驗顯示miR-214-3p與IKBKB的特異性結合；D.UALCAN網站預測結果圖；E.宮頸癌患者癌組織和癌旁組織中IKBKB的表達差異；F.miR-214-3p與IKBKB的相關性分析

注：<0.05

圖3 BMMSC及BMMSC源性外泌體鑒定

3 討論

腫瘤的發生、發展及臨床結局受其生物學功能的影響[11]。研究表明，腫瘤的生物學功能與腫瘤微環境密切相關[12]。間充質干細胞是重要的非腫瘤細胞之一，它可通過廣泛的信號傳導通路，與腫瘤細胞相互作用，參與誘導或抑制腫瘤進展和轉移[13]。研究表明，BMMSC具有腫瘤歸巢特性，它被認為是選擇性輸送抗癌藥物的理想載體[14]。但目前BMMSC外泌體源性miR-214-3p對宮頸癌的具體作用尚未闡明。

本研究發現，相較于癌旁組織，宮頸癌組織中的miR-214-3p表達下調，結合生物信息學分析推測miR-214-3p在宮頸癌中表達失調可能會促進宮頸癌發展。此外，使用qRT-PCR技術檢測BMMSC源性外泌體中miR-214-3p的含量，結果顯示外泌體中含有較高水平的miR-214-3p，將外泌體與宮頸癌細胞共轉染后宮頸癌細胞中的miR-214-3p表達也顯著上調，表明外泌體能為宮頸癌細胞中缺失的miR-214-3p做出貢獻。間充質干細胞外泌體miRNA有望成為腫瘤治療的新靶點。

研究顯示circ_0028171可通過miR-218-5p/IKBKB軸促進骨肉瘤組織的惡性行為[15]。IKBKB與宮頸癌發病也存在緊密聯系，如IKBKB表達上調可消除miR-429在宮頸癌中發揮的抑癌作用[16]。Tan等[17]研究發現IKBKB在宮頸癌組織中的表達高于癌旁組織。本研究中，雙熒光素酶報告實驗顯示，IKBKB與miR-214-3p存在特異性結合位點，IKBKB為miR-214-3p的靶基因，通過相關性分析發現宮頸癌細胞中IKBKB基因的表達與miR-214-3p呈負相關，且相較于癌旁組織，宮頸癌組織中IKBKB基因呈高表達狀態，表明在宮頸癌中miR-214-3p的表達被抑制而IKBKB基因表達上調。既往文獻證實NLRP3、caspase-1、銜接蛋白、消皮素D參與經典的細胞焦亡途徑，且焦亡過程伴隨著大量炎癥介質的釋放，如IL-1β、IL-6、IL-18等[18-19]。本研究結果顯示高表達miR-214-3p的宮頸癌細胞相關炎癥介質水平顯著升高，且NLRP3、caspase-1等物質的表達水平也較高，而在高表達miR-214-3p的基礎上上調IKBKB表達后，宮頸癌細胞中的相關炎癥介質水平明顯降低，且NLRP3、caspase-1等物質表達水平也大幅度降低，表明miR-214-3p的過表達可促進宮頸癌細胞產生大量炎癥介質，且這一過程與經典的細胞焦亡途徑相關。

圖4 各組細胞的NLRP3、caspase-1、銜接蛋白、消皮素D mRNA表達水平比較

圖5 各組細胞的IL-1β、IL-6、IL-18比較

綜上所述，BMMSC源性外泌體通過攜帶miR-214-3p調控IKBKB表達，可促進宮頸癌細胞焦亡。通過干預BMMSC外泌體中miR-214-3p的表達水平可為治療宮頸癌提供新的思路。

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Bone marrow mesenchymal stem cell exosome-derived miR-214-3p regulates IKBKB gene to promote pyroptosis of cervical cancer cells

LI Kangling, ZHANG Xiaodi, LIU Jue, ZHANG Zhiwei

1.Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, Hengyang 421000, Hunan, China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology, University of South China, Hengyang 421000, Hunan, China

To investigate the effects of exosome-derived miR-214-3p regulation of inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta (IKBKB) on cervical cancer cells by bone marrow mesenchymal stem cell (BMMSC).The abnormal expression of microRNAs in cervical cancer tissues was analyzed by bioinformatics method, and miR-214-3p was selected as the target gene and its downstream target gene IKBKB was identified, and the expression of miR-214-3p and IKBKB in cancer tissues and adjacent tissues of cervical cancer patients was detected. BMMSC exosomes were extracted and identified, the expression level of miR-214-3p in the exosomes was interfered, IKBKB overexpression plasmid was constructed, and the modified exosomes and plasmids were transfected into cervical cancer HeLa cells, respectively, and the relevant indicators of pyrodeath of cervical cancer cells in different groups were determined after transfection.Both bioinformatics and experimental detection showed that miR-214-3p was low expressed in cervical cancer tissues and cells, but high expressed in BMMSC exosomes, and BMMSC-derived exosomes could significantly increase the expression level of miR-214-3p in cervical cancer cells. IKBKB gene was the downstream target of miR-214-3p and was highly expressed in cervical cancer tissues and cells. Overexpression of miR-214-3p could promote the pyrodeath of cervical cancer cells, and the pyrodeath level of cervical cancer cells was significantly reduced after overexpression of IKBKB gene.The exosomes secreted by BMMSC regulate IKBKB by carrying miR-214-3p and promote the pyrodeath of cervical cancer cells.

Bone marrow mesenchymal stem cell; Exosome; miR-214-3p; IKBKB; Cervical cancer

R737.3

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.25.012

衡陽市指導性計劃項目（202121034447）

劉玨，電子信箱：lj3457@163.com

（2022–11–21）

（2023–08–10）