東北虎豹國家公園梅花鹿的空間遺傳格局及其影響因素

段興漢,吳 峰,張素青,鮑 蕾,王紅芳,*

1 生物多樣性與生態工程教育部重點實驗室,北京 100875 2 東北虎豹國家公園保護生態學國家林草局重點實驗室,北京 100875 3 北京師范大學生命科學學院,北京 100875

空間遺傳格局是物種在種群內或種群間遺傳多樣性的空間分布格局,種群遺傳學過程是空間遺傳格局形成的基礎,而景觀中斑塊、基質的空間配置、物種性狀差異可能增加了空間遺傳格局的復雜性[1]。然而,在不同物種或者不同生境下,這一期望格局的強度卻存在較大變異,主要原因是景觀基質可能影響種群間的功能連通度。多項研究表明,地理距離、地形、人造景觀、土壤類型、溫度、濕度等都對動植物分布有顯著的影響[2—5]。因此,探究物種的空間遺傳格局,分析格局形成的過程,有效識別可能的基因流障礙,可為制定有效種群保護策略提供依據。

東北梅花鹿(Cervusnipponhortuloru)是我國僅存梅花鹿三個亞種之一,種群數量相對較大。主要分布于我國吉林省、黑龍江以及俄羅斯濱海邊疆區連片的廣大地區。然而東北梅花鹿的空間分布十分不均勻。在我國,東北梅花鹿種群密度最高的地區為吉林省琿春市境內的中俄邊境線附近,而在其他大部分地區東北梅花鹿種群密度低[6]。梅花鹿作為食物鏈的初級消費者,該物種對植物群落的結構與功能具有很強的塑造作用[7]。此外,梅花鹿也是該地區旗艦物種東北虎(Pantheratigrisaltaica)、遠東豹(Pantherapardusorientalis)主要獵物,大型有蹄類動物的可獲得性與捕食者密度增加直接相關[8],因此梅花鹿對虎豹種群的分布與密度具有一定的限制作用。

本研究基于非損傷樣品對虎豹國家公園的梅花鹿進行遺傳多樣性和空間遺傳格局分析,以期了解該種群現有遺傳多樣性水平以及影響其空間遺傳格局的環境因素和人為因素。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

本研究于2018年8月至2020年1月多次在東北虎豹國家公園東部的中俄邊境附近采集梅花鹿糞便樣品110份(圖1)。為了滿足本研究需要,本研究采取嵌套式采樣策略[9],即在大、中、小不同距離等級下確保采集到的一定數量的樣品。

圖1 梅花鹿糞便樣品分布圖Fig.1 Map of the sika deer fecal samples

糞便樣品采集時佩戴一次性聚乙烯手套(PE手套)或使用一次性筷子,為防止交叉污染,采樣工具用后即換。采集的樣品原則上僅采集新鮮的糞便。每堆糞便挑取5—8粒,裝入50ml離心管中,記錄全球定位系統(GPS)坐標,避光處理;為了更好保存糞便樣品中的DNA,需要對樣品盡快干燥處理:(1)倒入適量95%無水乙醇,液面高度以沒過管內樣品為宜;(2)浸泡24h后將無水乙醇倒出,加入足量變色硅膠,加入無水乙醇或變色硅膠后,樣品可以常溫保存,否則應當低溫或冷凍保存;(3)每隔一周檢查離心管內硅膠的顏色,應在硅膠完全變紅之前及時更換,多數樣品在更換1—3次即可保持硅膠不再變色。

樣品質量信息的現場判斷較為重要,因為樣品越新鮮,DNA降解越少,質量較差的樣品往往導致擴增失敗。在野外可根據如下標準判斷梅花鹿糞便樣品的新鮮程度:

a)分散程度。糞球不成堆分布的,形態大小明顯不同的幾堆糞便混雜在一起的,應當舍棄。

b)表面物理特征。新鮮糞便表面一般呈現黃色或深褐色,糞球形狀飽滿,表面光亮、黏滑,沒有裂紋,不長霉。糞便在野外暴露一定時間后表面一般會變黑、變硬,表面出現裂紋,裂紋越多說明在野外暴露時間越久。

c)軟硬程度。一般來說糞便越軟越新鮮。

d)被枯枝落葉、積雪等覆蓋的一般不新鮮,可根據降雪時間判斷糞便質量。

e)梅花鹿臥跡內或1m范圍內、撥雪取食痕跡附近一般可尋獲糞便,因此可根據臥痕、咬痕、足跡等新鮮程度判斷糞便新鮮程度。

f)冬季采集的糞便一般都能夠滿足樣品DNA提取和分型的需要,但是冬季采集時要注意不要采集表面開裂、位于落葉層以下或與土壤黏連的糞便。

1.2 糞便基因組提取、個體鑒定

本研究使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAamp)進行糞便基因組提取。為確認糞便樣品所屬物種,選用Riaz等[10]開發的鹿科動物通用引物12srRNA對糞便DNA進行擴增。引物序列如下,F: TAG AAC AGG CTC CTC TAG;R: TTA GAT ACC CCA CTA TGC。PCR反應體系為40μL:20μL 2×EasyTaq PCR SuperMix,0.8μL BSA,引物各0.8μL(10μMol),4μLDNA模板,加13.6μL超純水補足。聚合酶鏈式反應(PCR)程序為:94℃預變性5min;94℃變性30s,51℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環;72℃延伸10min。本研究測序和引物合成由北京擎科新業生物技術有限公司完成。測序結果質量使用Codoncode Aligner 6.0.2進行檢測。利用美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫進行數據比對(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),設置匹配度100%,確定糞便樣品所屬物種。

1.3 微衛星的篩選和分型

本研究根據過去使用率較高的有蹄類動物微衛星序列,篩選出9對穩定擴增且多態性較高的引物(表2)。擴增體系:Takara Taq HS 0.5μL,10X PCR Buffer (Mg2+Plus) 2μL,dNTP Mixture 2μL,引物各0.5μL,BSA 1μL,DNA模板 3μL,加超純水至20μL。擴增程序:95℃預變性5min;95℃變性30s,退火30s,72℃延伸1min,進行35個循環;72℃終延伸10min。PCR擴增產物使用ABI 3730測序儀測序。微衛星數據的讀取和校正在Genemapper 4.0中完成。

表1 各種變量對梅花鹿種群遺傳格局影響的假設Table 1 Hypothesis of the influence of different variables on genetic pattern of sika deer population

表2 野生東北梅花鹿種群9個微衛星位點分析Table 2 The analysis of 9 microsatellites locus in wild sika deer population

由于糞便DNA質量差,等位基因容易丟失。為了避免這種現象,本研究采用多管擴增法(multi-tube PCR)進行個體基因型確定[11],基本方法如下:雜合子由至少兩次相同的分型結果確定,而純合子則由3次相同分型結果確定。每份樣品每個位點先進行4次重復擴增,判斷基因型結果;對仍然無法確定分型情況的樣品再進行3次獨立擴增,判斷基因型。此后仍無法確定基因型的樣品,則將該個體的該位點處理為缺失數據。

1.4 數據分析

1.4.1遺傳多樣性

利用GIMLET 1.3.1[12]計算微衛星位點的鑒別能力:同一性概率(PID)和同懷群同一性概率(PIDsibling);使用MICRO-CHECKER[13]檢查各微衛星位點是否存在無效等位基因、等位基因丟失的現象。使用CERVUS和FSTAT 2.9.3.2[14]計算位點等位基因數量(Na)、有效等位基因數量(Ne)、觀測雜合度(HE)、期望雜合度(HO)、多態信息含量(PIC)等種群遺傳學指標;使用Genepop 3.4[15]檢查每個位點的哈溫平衡和連鎖平衡。

使用CERVUS[16]進行個體鑒別。

1.4.2聚類分析

使用STRUCTURE 2.3.4[17]軟件對鑒定的所有梅花鹿個體遺傳結構進行分析。計算過程采用混合祖先模型和等位基因關聯模型,開始時的預迭代次數為105,馬爾可夫鏈蒙特卡羅迭代(MCMC)重復次數為104次,K值范圍定為K=1—6,對每個K進行20次重復運算。利用Structure Harvester最大似然值以及ΔK隨K值的變化,綜合判斷梅花鹿種群的最優分組。

使用GenAlEx 6.5[18]對鑒定的所有梅花鹿個體做主坐標分析。

1.4.3空間自相關分析

有限的擴散能力常常導致種群在遺傳距離上具有顯著的空間自相關模式[19]。本研究首先使用MSA 4.05[20]軟件計算個體兩兩之間的遺傳距離,距離指標為共有等位基因比例。個體間的地理距離,以及空間自相關檢驗都在GenAIEx中進行。空間自相關檢驗的置換數設置為999次。

1.4.4空間變量對遺傳分化影響分析

本研究主要分析了海拔、坡度、坡向、地表起伏率(Surface Relief Ratio, SRR)、人類干擾5個變量對梅花鹿種群遺傳結構的影響。這5個變量多被認為與大中型哺乳動物擴散阻礙相關[21]。前四個變量來自于分辨率30m×30m的DEM 數據(http://www.usgs.gov/)。人類干擾使用道路、居民點圖層進行模擬。

各種環境變量的阻力模型通過ArcGIS 10.1中的“空間分析工具”下的“重分類工具”建立。

(1)海拔:隨海拔升高溫度降低,因此海拔可能影響梅花鹿的食物可獲得性,對梅花鹿來說可能存在一個最適海拔。本研究利用逆高斯方程模擬[22]海拔高度對擴散的影響:

海拔高度分為9組,每組間距100m。Rmax為最大阻力值,分別設為2、10、100、500、1000。Eopt為梅花鹿擴散最適海拔高度,分別設為200、300、400、500m。ESD分別設為50、100、200m。基于以上3個參數,建立60個海拔高度阻力模型。

(2)坡度:從運動時的能量消耗角度推測,梅花鹿可能更傾向于利用較緩坡度。本研究用逆高斯方程模擬坡度對梅花鹿擴散的阻礙作用:

坡度分為9組,每組間距7°。Rmax為最大阻力值,分別設為2、10、100、500、1000,θopt為梅花鹿擴散最適坡度,分別設為5°、10°、15°、20°、30°,θSD分別設為2°、5°、10°。基于以上3個參數,建立75個坡度阻力模型。

(3)坡向:坡向不同,溫度、濕度等微生境不同,從而可能影響梅花鹿的生境選擇和擴散通道的選擇。用熱負荷指標函數模擬坡向對梅花鹿的擴散阻礙[22]:

坡向分為9組,8組為坡向組,一組為平面組(-1°)。坡向組每組范圍為45°,平面組賦值為Rmax/2,其他按上述函數進行賦值。Rmax分別設為2、10、100、500、1000,θopt分別設為0°、45°、90°、135°、180°、225°、270°、315°。x設為0.5、2、10。基于以上3個參數,建立坡向阻力模型120個。

(4)地表起伏率:地表復雜程度將影響梅花鹿運動時的能量消耗,地形復雜程度越高,梅花鹿擴散時的能量消耗越大。SRR對動物擴散的阻力由以下函數進行模擬[22]:

R=(SRRx)×Rmax+1

建立SRR阻力模型之前,首先下載Geomorphometry and Gradient Metrics 2.0工具(https://github.com/jeffreyevans/GradientMetrics),并使用ArcCatalog加載至工具箱中,然后打開ArcMap,使用該工具中的Surface Relief Ratio工具對研究區域的DEM進行重分類:分析窗口設置為“Circle”,半徑分別設置為2、10、25、50,分析單元為“Cell”。再對4個不同半徑的SRR柵格圖層分別進行重分類,SRR值共分為10組,每組組距為0.1。Rmax分別設為2、10、100、500、1000,x分別為0.5、2、10。建立SRR阻力模型60個。

(5)建立人類干擾阻力模型6個。根據居民點、道路分布情況,首先在ArcMap中使用BufferWizard工具,對道路、村、鎮矢量分別設置1km、1.5km、3km緩沖區;然后使用Union工具,將3個緩沖區圖層合并,在屬性表中新建一列,使用“Field calculator”將該列賦值為10,同時用同樣的方法將研究區矢量圖的該列賦值為1;再次使用Union工具將兩個圖層合并。最后使用“Circuitscape for Arcgis”工具,將矢量轉換為柵格格式。使用重分類功能,將不包含居民點和道路的柵格的阻力值設置為1,其他柵格的阻力值R分別設為2、10、100、250、500、1000。

(6)建立空間距離阻力模型1個。對DEM柵格進行重分類,將所有柵格賦值為1,以便后續分析中排除空間自相關對遺傳距離的影響。

(7)利用生境適宜性模型建立15個阻力模型。首先使用MaxEnt 3.4.1[23]制作生境適宜性圖層,選取的變量為海拔、坡度、坡向、地表起伏率等4個環境變量以及與居民點距離、與省道距離2個人類干擾變量。這些變量數據來源及處理方法如上所述。考慮到變量間可能存在相關性影響模型精度,先對所有變量因子做相關性分析,去除相關系數絕對值大于0.75的變量。共計379個梅花鹿出現點數據來源于梅花鹿糞便樣品坐標以及本實驗室近幾年紅外相機數據。本研究選擇線性、二次方、乘積和多拐點閾值關系等4種運算方法的綜合運用;由于測試樣本比例對模型預測精度有一定影響,所以本研究首先以不同的測試樣本比例進行模擬,每個比例重復10次,篩選出平均AUC最高(25%,0.861)的一個生境適宜性圖層。

隨后依據該模型建立15個阻力模型。由于該圖層取值范圍為H=0—1,值越大代表生境適宜性越高,所以根據以下方式進行重分類:

R=(1-H)x×Rmax+1

生境適宜性值共分為10組,每組組距為0.1。Rmax分別設為2、10、100、500、1000,x分別為0.5、2、10。

阻力模型建立完成后,使用Circuitscape for ArcGIS工具生成各變量的不同模型的阻力矩陣。計算模式為成對的模式、連接附近8個柵格。

使用R包ecodist[24]進行偏曼特爾檢驗,在排除空間自相關(IBD)的影響后,分析遺傳距離(GD)和景觀阻力(LR)的相關性。可表示為GD-LR|IBD,其中GD為遺傳距離,LR為景觀變量阻力,IBD為空間自相關。對任一景觀變量模型進行檢驗時,當GD—LR|IBD的結果顯著,而GD—IBD|LR的結果不顯著時,才認定該模型能夠解釋個體間的遺傳變異模式[21]。

2 結果與分析

2.1 物種鑒定和微衛星分型

使用12srRNA對110份糞便樣品進行擴增,其中101份樣品測序成功。通過基于局部比對算法的搜索工具(BLAST)分析,除了7份樣品為狍(Capreoluscapreolus)糞便外,其他94份樣品均為梅花鹿糞便樣品。利用Gimlet軟件計算發現,這9對微衛星位點的聯合識別分辨率較高。PIDunbiased=7.892×10-10,PIDbiased=1.468×10-9,PIDsibling=3.663×10-4;通過Cervus軟件進行個體鑒別,在成功擴增的87份樣品中,鑒別出86個個體。在所使用的9個微衛星位點中,所有位點都符合遺傳連鎖平衡,RT1、RM188、BM6506顯著的偏離哈溫平衡,且可能存在無效等位基因。由于這三個位點在梅花鹿種群遺傳多樣性研究中廣泛使用,且RT1和RM188具有較高的等位基因數量和遺傳多樣性,為個體鑒定提供了更精準的信息,本研究保留這三個位點。

2.2 種群遺傳多樣性

本研究所使用的9對微衛星的等位基因數量在4—11之間,共擴增出68個等位基因(表2)。平均每個位點有7.56個等位基因,其中RT1等位基因最多,有11個等位基因,BM6506位點等位基因最少,有4個等位基因。這9個梅花鹿微衛星位點平均多態信息含量(PIC)為0.683,除BM6506(PIC=0.410)之外,其余位點的多態信息含量都在0.631—0.798之間,由于PIC>0.5為高度多態性,0.25≤PIC≤0.5為中度多態性,因此,BM6506為中度多態性位點,其余均為高度多態性位點。觀測雜合度位于0.346—0.886之間,平均觀測雜合度為0.689;期望雜合度位于0.472—0.842之間,平均期望雜合度為0.721。期望雜合度普遍高于觀測雜合度。

2.3 種群遺傳結構

STRUCTURE得出聚類數量估計值。L(K)峰值出現在K=1(圖2),因此該地區梅花鹿最有可能的分群數量為K=1,當K>1時,種群中的個體被分到不同群的比例大致相當,說明本研究的目標種群棲息的景觀中不存在顯著的屏障效應。

圖2 采用貝葉斯聚類分析方法得到的聚類數量估計值 Fig.2 Estimated number of clusters inferred using Bayesian clustering analysisL(K)的峰值出現在K=1處

主坐標分析(PCoA)表明(圖3),所有樣品點未形成明顯的聚集分布。結合STRUCTURE和PCoA結果,推測該地區沒有明顯的遺傳分組,該種群處于哈溫平衡。

圖3 梅花鹿種群的主坐標分析Fig.3 Principal Coordinates (PCoA) Analysis of the sika deer population圖中各點為本研究的全部樣品

Ta:退火溫度 Annealing temperature;N:樣本量 Sample Size;Na:等位基因數量 No. Alleles;Ne:有效等位基因數量 No. Effective Alleles;PIC:多態信息含量 Polymorphic Information Content;HO:觀測雜合度 Observed Heterozygosity;HE為期望雜合度 Expected Heterozygosity;*代表該位點偏離哈溫平衡并且存在無效等位基因

2.4 空間自相關分析

對該地區東北梅花鹿種群85km范圍內的空間自相關分析表明,該地區的梅花鹿出現一定的空間結構。在第一個(0—5km,r=0.017,P=0.003)、第二個(5—10km,r=-0.009,P=0.043)空間等級表現為顯著的空間自相關系數。在0—85km內的所有距離等級內,r值有正有負,呈現明顯的波動格局(圖4)。

圖4 梅花鹿種群空間自相關分析Fig.4 Spatial autocorrelation analysis of sika deer population

對該地區東北梅花鹿種群10km范圍內的空間自相關分析表明,該地區的梅花鹿出現一定的空間結構。在第1個(0—1km,r=0.043,P=0.002)、第9個(8—9km,r=-0.030,P=0.039)、第10個(9—10km,r=-0.025,P=0.016)空間等級表現為顯著的空間自相關系數。在0—10km內的所有距離等級內,r值有正有負,呈現明顯的波動格局(圖4)。

2.5 空間變量對遺傳分化影響分析

利用ArcGIS建立共計336個阻力模型,其中海拔阻力模型60個,坡度阻力模型75個,坡向阻力模型120個,地表起伏率阻力模型60個,人類干擾阻力模型6個,生境適宜性阻力模型15個。

在所有336個模型中,依據海拔、坡向、地表起伏率、人類干擾假設建立的246個阻力模型與遺傳距離之間的關系并不顯著(P>0.05)。在依據坡度假設建構的75個阻力模型中,只有1個模型與遺傳距離有顯著的正相關關系(P<0.05,表3),該模型同時也是在控制空間自相關影響后,在所有模型中與遺傳距離相關性最高(r=0.088)的模型。綜合所有變量的15個生境適宜性模型阻力模型與遺傳距離的關系也都不顯著。

表3 排除空間自相關影響后最佳阻力模型Table 3 Best resistance models when partialling out the effect of IBD

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量生物種群健康程度的一項重要指標。研究發現,虎豹國家公園梅花鹿種群每個位點平均有7.56個等位基因,平均觀測雜合度為0.689,平均期望雜合度為0.721。梅花鹿各地區亞種的遺傳多樣性已有許多報道(表4),劉鑫鑫[30]、王美楠[31]、朱明月[32]的目標種群均為野生東北亞種,且采樣點與本研究采樣區域臨近,均位于東北虎豹國家公園內或臨近區域。本研究期望雜合度數值略低于或等于以上三項研究。東北梅花鹿在琿春保護區、汪清保護區、黑龍江綏陽老爺嶺保護區等地呈現連續分布的格局,該地區沒有阻礙梅花鹿擴散的高速公路、大型山脈或大型河流。同時,各項研究采樣時間也在5年之內,可認為該地區梅花鹿種群沒有較大波動。

表4 不同地區野生梅花鹿基于微衛星的遺傳多樣性比較Table 4 Comparison of genetic diversity based on microsatellite of wild sika deer in different regions

通過與其他地區梅花鹿亞種對比發現,東北梅花鹿期望雜合度普遍高于其他亞種(表4)。東北梅花鹿可能比其他地區梅花鹿亞種保存有更多的遺傳多樣性。

棲息地范圍以及生境質量可能是影響梅花鹿遺傳多樣性的一個重要因素。我國境內的野生東北梅花鹿種群靠近中俄邊境線,主要分布在東北虎豹國家公園東部地區。而在俄羅斯一側的濱海邊疆區(Primorsky Krai)存在著西南、中部、東南等3個相互聯系著的大型梅花鹿種群,其中,西南種群分布范圍位于中俄邊境附近[35]。經粗略估計,俄羅斯梅花鹿種群的分布面積約為中國境內野生東北梅花鹿分布區的17倍。中國的梅花鹿種群很可能是俄羅斯一側梅花鹿的擴散種群。同時,俄羅斯濱海邊疆區人煙稀少,人類對生態環境的干擾較小,有利于梅花鹿種群的繁衍和擴散。更大的分布面積和更小的人類干擾則意味著可以供養更大的梅花鹿種群,就可能會產生較高的遺傳多樣性。

在中國的其他梅花鹿分布區,梅花鹿原有生境逐漸被人類擠占,棲息地破碎化不斷加劇。例如,梅花鹿四川亞種種群被限制在四川若爾蓋縣凍列、崇爾、熱爾、占哇、降扎5個地區[36];梅花鹿華南亞種種群分布區被分割為位于江西、安徽和浙江的桃紅嶺、天目山、黃袞山、大會山等多個相互隔離的區域內[37]。

3.2 遺傳結構及影響因素分析

通過分析該種群的遺傳結構可知,本研究區梅花鹿種群沒有明顯的遺傳結構,這可以由研究區范圍內的地理、水文、人類干擾情況所解釋。該地區不存在大型山脈、大型河流和高等級的道路,因此也沒有能夠影響梅花鹿擴散的客觀障礙。在梅花鹿分布區內,雖然存在一些硬化道路,但在野外可經常觀察到有鹿群穿越。此外,保護區內的居民點規模較小,也不太可能影響梅花鹿擴散。

對該地區東北梅花鹿種群10km范圍內的空間自相關分析表明,在第1個(0—1km)、第9個(8—9km)、第10個(9—10km)空間等級表現為顯著的空間自相關系數,而其他距離等級的個體之間沒有顯著的相關關系。這說明遺傳相關性僅存在于臨近的個體之間。據此可推測,該地區梅花鹿擴散距離為1km左右。

利用GPS項圈方法,Kim等[38]得出韓國俗離山國家公園的梅花鹿的年度家域面積為(2.24±1.50)km2;Yu[39]在日本日光國立公園測得雄鹿夏季家域面積(1.93±0.51)km2,雌鹿夏季家域面積(1.12±0.57)km2;而Takafumi[40]發現日本釧路濕地的梅花鹿平均家域面積為(6.8±1.8)km2。有研究表明,梅花鹿家域面積隨著單位面積內個體數量的增加而減小。雖然梅花鹿存在季節性遷徙現象,但是梅花鹿一般在生長季又會遷回并利用原來的棲息地,具有較強的家域固定性[41],因此,梅花鹿在交配時可能也會選擇空間臨近的個體。本研究結果在一定程度上與前人研究相符。

在梅花鹿的棲息地,除空間距離以外,還有很多其他環境因素可潛在影響梅花鹿種群的遺傳模式。過去大量研究集中于梅花鹿的生境選擇偏好,而基本沒有研究探討環境因素對梅花鹿遺傳格局的影響。本研究中,只有坡度被證明與該地區梅花鹿種群遺傳多樣性的空間格局相關。對梅花鹿生境選擇和占域研究表明,梅花鹿傾向于利用坡度小于25°的區域[42],坡度平緩的區域,梅花鹿的占域率也相對較高[43]。這與梅花鹿生存策略相一致。梅花鹿傾向于在緩坡進行求偶、交配等活動,為了節約能量,梅花鹿也傾向于從平緩地帶擴散。

納入研究的其他幾個變量被認為是影響動物種群遺傳模式的潛在因素,如Ma等[21]發現地表起伏率和坡向影響了秦嶺大熊貓的遺傳格局;美洲旱獺的遺傳格局受到海拔、道路、樹木胸高直徑、植被覆蓋等因素的影響[44]。同時,河流、坡向、水系等因素對美洲鼠兔種群的基因流造成顯著影響[22]。然而,當棲息地高度連接或棲息地與非棲息地之間的阻力差異較小,即景觀結構無法對基因流造成限制時,往往無法檢測到景觀遺傳效應[45]。

本研究雖然為每個變量構建一系列不同的阻力模型,但仍然未能探明其余變量與梅花鹿遺傳格局的相關性。其他幾個環境變量對梅花鹿遺傳格局的影響可能受到遺傳取樣策略、景觀要素分布格局等因素的共同影響。由于國家公園西部梅花鹿分布較為稀少,糞便采集難度大,因此本研究未能將研究區向西拓展,未能將國家公園西部更大范圍、更為復雜的各種環境特征納入景觀遺傳學分析中,客觀限制了本研究的深度和廣度。Manel等[46]研究表明,樣本量的多少以及樣本的空間布局將極大地影響后續空間統計方法檢測模式的能力,非最佳采樣方案需要更高的樣本量。此外,有關模擬研究證明,一種景觀變量在棲息地和非棲息地間若存在較高的對比度,則對該變量對種群遺傳的影響的檢測將更容易[47],而本研究所在區域未見有明顯的邊界將梅花鹿種群相互分隔開來。

遺傳位點取樣的偏差也可能引起檢驗偏差。當微衛星位點存在無效等位基因時,即在該位點存在不能成功擴增的等位基因,一方面可能低估群體的遺傳多樣性,另一方面也容易使親緣關系分析結果產生偏差。盡管如此,本文的遺傳多樣性估計結果基本和文獻報道一致(表4)。因此,盡管少部分使用的微衛星位點存在無效等位基因對結果存在影響,但這種影響是有限的。

若想進一步驗證梅花鹿的擴散是否傾向于避開陡坡或與其他變量相關,研究可結合無線電項圈技術以及運動生理學相關研究,如將由項圈得到實際運動路徑與模型模擬路徑進行比較分析,或從生理學角度探討穿越不同景觀要素時給動物帶來的能量損耗。為進一步研究東北虎豹國家公園各種環境變量對動物遺傳格局的影響,可選擇旗艦物種東北虎、東北豹,或全域分布的狍、野豬等作為研究對象,可進一步為野生動物擴散廊道設計提供指導。高通量測序技術的發展為檢測大量遺傳標記與環境變量之間的關聯提供技術支撐,景觀基因組學相關方法將彌補傳統景觀遺傳學方法的不足,可以更加高效和準確地檢測動物種群的微進化格局。